[发明专利]用于加工DNA底物的改进方法

摘要

本发明描述了将衔接体连接至片段化的双链DNA分子的端部的方法。这种新方法克服了向DNA片段的5’端添加磷酸基团的需要。相反，5’末端碱基由于DNA的物理片段化而被破坏。通过去除破坏的碱基，具有5’磷酸的连接相容性碱基暴露并且衔接体连接效率恢复，导致从减少的输入DNA量构建文库的能力和文库产量显著增加。

主权项

1.一种基于多重PCR的靶标底物富集方法，包括以下步骤：(i)将多种聚合酶链式反应组分引入包含核酸底物的样品以提供PCR反应混合物，其中所述多种聚合酶链式反应组分包括用于扩增所述核酸底物的多个不同基因座的多种不同的靶标特异性引物对、通用引物、DNA聚合酶、和dNTP，其中所述多种不同的靶标特异性引物对各自包含正向引物和反向引物，其中所述正向引物和所述反向引物分别包含与所述核酸底物的第一序列和所述核酸底物的第二序列互补的3’互补序列，其中所述多种不同的靶标特异性引物对各自的第一序列和第二序列不同，并且其中所述多种不同的靶标特异性引物对各自的正向引物和反向引物还包含不与所述核酸底物互补的5’末端序列，其中所述5’末端序列包含通用衔接体序列，其中所述通用引物包含修饰的通用衔接体序列，其中所述修饰的通用衔接体序列具有修饰的碱基，其中所述修饰的碱基靶向核酸内切酶对所述通用引物的切割，其中所述修饰的通用衔接体序列和所述通用衔接体序列与共同的序列互补，并且其中所述通用引物在PCR反应混合物中的终浓度相对于所述多种不同的靶标特异性引物对各自的终浓度过量；(ii)将所述PCR反应混合物暴露于至少两个最初PCR循环，所述最初PCR循环包括第一退火温度持续第一退火时间以生成多种不同的靶标特异性扩增子，其中所述多种不同的靶标特异性扩增子各自在其5’末端区域包含5’末端序列；(iii)将所述PCR反应混合物暴露于合适数量的额外PCR循环以进一步扩增所述多种不同的靶标特异性扩增子，其中所述额外PCR循环包括第一退火温度持续第二退火时间，其中所述第一退火时间大于所述第二退火时间。