[发明专利]用于加工DNA底物的改进方法

权利要求书

1.一种基于多重PCR的靶标底物富集方法，包括以下步骤：

(i)将多种聚合酶链式反应组分引入包含核酸底物的样品以提供PCR反应混合物，其中所述多种聚合酶链式反应组分包括用于扩增所述核酸底物的多个不同基因座的多种不同的靶标特异性引物对、通用引物、DNA聚合酶、和dNTP，其中所述多种不同的靶标特异性引物对各自包含正向引物和反向引物，其中所述正向引物和所述反向引物分别包含与所述核酸底物的第一序列和所述核酸底物的第二序列互补的3’互补序列，其中所述多种不同的靶标特异性引物对各自的第一序列和第二序列不同，并且其中所述多种不同的靶标特异性引物对各自的正向引物和反向引物还包含不与所述核酸底物互补的5’末端序列，其中所述5’末端序列包含通用衔接体序列，其中所述通用引物包含修饰的通用衔接体序列，其中所述修饰的通用衔接体序列具有修饰的碱基，其中所述修饰的碱基靶向核酸内切酶对所述通用引物的切割，其中所述修饰的通用衔接体序列和所述通用衔接体序列与共同的序列互补，并且其中所述通用引物在PCR反应混合物中的终浓度相对于所述多种不同的靶标特异性引物对各自的终浓度过量；

(ii)将所述PCR反应混合物暴露于至少两个最初PCR循环，所述最初PCR循环包括第一退火温度持续第一退火时间以生成多种不同的靶标特异性扩增子，其中所述多种不同的靶标特异性扩增子各自在其5’末端区域包含5’末端序列；

(iii)将所述PCR反应混合物暴露于合适数量的额外PCR循环以进一步扩增所述多种不同的靶标特异性扩增子，其中所述额外PCR循环包括第一退火温度持续第二退火时间，其中所述第一退火时间大于所述第二退火时间。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述多种不同的靶标特异性引物对各自的正向引物和反向引物中的一个或两个还在其5’末端序列中包含简并序列，其中所述简并序列位于所述3’互补序列和所述通用衔接体序列之间。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述修饰的碱基是脱氧尿嘧啶、RNA、脱氧次黄苷，或肌苷。

4.如权利要求3所述的方法，其中所述DNA聚合酶是高保真DNA聚合酶，其耐受修饰的碱基。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述通用引物还在其3’末端包含抗核酸酶的修饰。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述抗核酸酶的修饰是硫代磷酸酯连接。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述多种不同的靶标特异性引物对各自的正向引物和反向引物还在其3’末端包含抗核酸酶的修饰。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述多种不同的靶标特异性引物对各自与通用引物的摩尔比为至少1∶100。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述多种不同的靶标特异性扩增子包括第一靶标特异性扩增子和第二靶标特异性扩增子，其中所述第一靶标特异性扩增子包含与所述第二靶标特异性扩增子重叠的区域和不与所述第二靶标特异性扩增子重叠的区域。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述多种不同的靶标特异性扩增子中的至少一个包含两个与所述多种不同的靶标特异性扩增子中的其他两个重叠的区域和一个不与所述多种不同的靶标特异性扩增子中的任何其他扩增子重叠的区域。

11.如权利要求1所述的方法，其中所述第一退火时间是5分钟或更久。

12.如权利要求1所述的方法，其中所述第二退火时间是1分钟或更短。

13.如权利要求1所述的方法，其中步骤(ii)是2个PCR循环。

14.如权利要求1所述的方法，其中步骤(ii)是至少4个PCR循环。