[发明专利]一种人类红细胞血型系统ABO抗原的多重PCR-SBT基因分型方法及试剂

摘要

本发明属于基因分型检测方法技术领域，具体涉及一种用于人类红细胞血型系统ABO抗原的多重PCR‑SBT基因分型方法。本发明还涉及一种人类红细胞血型系统ABO抗原基因分型的多重PCR‑SBT试剂。本发明所提供的试剂和方法可作为一种独立的、应用广泛的鉴定方法，解决了ABO抗原系统快速准确定型的问题，发挥多重PCR‑SBT对ABO基因定型操作高通量、结果准确的特点，在临床输血医学研究和遗传学等领域的相关应用将受到高度重视，对于医学研究单位、药学研究和试剂开发单位具有重要的现实意义。

主权项

1.一种人类红细胞血型系统ABO抗原的多重PCR‑SBT基因分型方法，其特征在于：所述方法对ABO抗原基因全部1‑7号外显子进行分组多重PCR扩增和测序分型，并包括以下步骤：(1)设计并合成多重PCR扩增引物，其包含ABO抗原基因特异性序列和通用接头序列；(2)制备人基因组DNA；(3)两组多重PCR反应扩增人基因组DNA中ABO抗原基因1‑7号外显子序列；(4)将步骤(3)得到的扩增产物进行双酶切纯化；(5)提供寡核苷酸测序引物，将步骤(4)得到的双酶切纯化产物进行测序PCR反应；(6)将步骤(5)得到的测序产物进行醋酸钠‑乙醇沉淀法纯化，并进行毛细管电泳测序；(7)将步骤(6)获得的序列通过软件分析，确定其基因型；所述步骤(1)中多重PCR扩增引物序列分别为：ABO基因1号外显子扩增引物：ABO‑E1F 5’‑TTCCAAAATGTCGTAATAACGCCGTCCCTTCCTAGCAG‑3’ABO‑E1R 5’‑ATTATAGAGGACACCTAGTCGGCGGTAGGTGCTGAAAATA‑3’ABO基因2号外显子扩增引物：ABO‑E2F 5’‑TGTAAAACGACGGCCAGT GTAAAGTGGGGCAGGTGAGA‑3’ABO‑E2R 5’‑CAGGAAACAGCTATGACC TGATACTTGGGGAGCTCAGG‑3’ABO基因3号外显子扩增引物：ABO‑E3F 5’‑ACGTGGGTATAAGAGGCG ACCAACAGGCAGTCTTCGTT‑3’ABO‑E3R 5’‑CGATGCTAGACGATCCAG TGTAGGGGTGAGAGCAAAGG‑3’ABO基因4号外显子扩增引物：ABO‑E4F 5’‑TCTAAAAGCTGCGGAATTGTTGCCCTAAATCCTGCTCCTA‑3’ABO‑E4R 5’‑TCCAAACTCATCAATGTATCGCTGCAGGACAATTCTGTGA‑3’ABO基因5号外显子扩增引物：ABO‑E5F 5’‑TCTAAAAGCTGCGGAATTGT GTCAATGCCCAGTCATGGTT‑3’ABO‑E5R 5’‑TCCAAACTCATCAATGTATC GGAAACCGCCCTCTAATACC‑3’ABO基因6号外显子扩增引物：ABO‑E6F 5’‑TGTAAAACGACGGCCAGTGGAGGMAGAAGCTGAGTGGAG‑3’ABO‑E6R 5’‑CAGGAAACAGCTATGACCC CTACCMTCTGGGAGGACAA‑3’ABO基因7号外显子扩增引物：ABO‑E7F 5’‑AGGASTCGCTCAGGACAGG‑3’ABO‑E7R 5’‑CCRGTTCTGCTAAAACCAAG‑3’所述步骤(3)中两组多重PCR反应体系包括：第1组4重PCR反应体系为：2×GC buffer 10μl；2.5mM dNTP 1.6μl；50mM所述扩增引物ABO‑E1F 0.12μl+ABO‑E1R 0.12μl、ABO‑E2F 0.08μl+ABO‑E2R 0.08μl、ABO‑E3F 0.08μl+ABO‑E3R 0.08μl、ABO‑E4F 0.08μl+ABO‑E4R 0.08μl；5U/μl LA Taq酶0.1μl，100ng/μl DNA 2.0μl；以H2O 5.58μl补足至20μl；第2组3重PCR反应体系为：2×GC buffer 10μl；2.5mM dNTP 1.6μl；50mM所述扩增引物ABO‑E5F 0.08μl+ABO‑E5R 0.08μl、ABO‑E6F 0.2μl+ABO‑E6R 0.2μl、ABO‑E7F 0.12μl+ABO‑E7R 0.12μl；5U/μl LA Taq酶0.1μl，100ng/μl DNA 2.0μl；以H2O 5.5μl补足至20μl。