[发明专利]一种人类红细胞血型系统ABO抗原的多重PCR-SBT基因分型方法及试剂

说明书

本发明属于基因分型检测方法技术领域，具体涉及一种用于人类红细胞血型系统ABO抗原的多重PCR‑SBT基因分型方法。本发明还涉及一种人类红细胞血型系统ABO抗原基因分型的多重PCR‑SBT试剂。本发明所提供的试剂和方法可作为一种独立的、应用广泛的鉴定方法，解决了ABO抗原系统快速准确定型的问题，发挥多重PCR‑SBT对ABO基因定型操作高通量、结果准确的特点，在临床输血医学研究和遗传学等领域的相关应用将受到高度重视，对于医学研究单位、药学研究和试剂开发单位具有重要的现实意义。

技术领域

本发明属于基因分型检测方法技术领域，具体涉及一种用于人类红细胞血型系统ABO抗原的多重PCR-SBT基因分型方法。本发明还涉及一种人类红细胞血型系统ABO抗原基因分型的多重PCR-SBT试剂。

背景技术

人类ABO抗原是ABO血型系统中重要的抗原，ABO基因位于9号染色体(9q34.1～34.2)，由A、B和O三个复等位基因控制，包含长度大小从28～688bp不等的7个外显子和长度约为19514bp的6个内含子，总长大约为18～20kb。其基因编码产物是糖基转移酶，这些转移酶控制ABO血型抗原的生物合成，从而决定其血型。

目前的ABO血型基因分型最主要的方法是PCR-SSP(PCR-序列特异性引物)，但该方法需要进行多管扩增，并且PCR-SSP方法在设计引物时只能针对某些具有区别性的特异性位点进行设计，因此只能对常规的ABO血型进行基因分型，对于一些特殊的亚型或存在的新突变位点则难以明确。同时PCR-SSP还存在判读易混淆所导致分型错误的分险。而现有的ABO血型PCR-SBT(PCR-Sequence based typing，基于PCR测序的分型技术)分型方法虽然可以克服前者的缺陷和局限性，但现阶段的ABO血型PCR-SBT分型方法最大的缺陷是操作过程非常繁琐，工作量大，难以实现高通量操作。ABO基因不同区域的扩增有不同的扩增条件，不仅需要的样本量大，同时增加了试剂耗材的消耗，且需要占用更多的仪器设备资源。扩增引物和测序引物无共通性，从扩增的几管反应直接放大到测序的十几管反应，工作量巨大。这些缺陷直接导致了ABO基因分型无法实现高通量的精准分型，难以适应将来越来越高的医疗需求。

多重PCR(Multiplex PCR)是在同一个反应中同时扩增两个或多个位点的聚合链式反应。它具有提高效率，避免样品浪费，快速周转时间，并可大大节约实验成本的优点。建立ABO基因分型的多重PCR-SBT方法，可以克服上述局限性和不足，达到快速且准确地确认献血者和临床患者的ABO血型。实现快速、简便而精准化的血型诊断，将有效提高输血安全。

发明内容

针对现有技术中ABO基因分型的缺陷，给血型诊断过程中带来的困难，本发明的第一个目的在于提供了一种用于人类红细胞血型系统ABO抗原的多重PCR-SBT基因分型方法，本发明所提供的方法大大缩短了实验时间，节约了实验成本，提高了实验效率，在保证ABO基因正确分型的基础上，使ABO基因分型可以实现高通量，克服了现有血型分型技术中的缺陷。

为此，本发明的上述目的通过以下技术方案来实现：

一种人类红细胞血型系统ABO抗原的多重PCR-SBT基因分型方法，所述方法对ABO抗原基因全部1-7号外显子进行分组多重PCR扩增和测序分型，并包括以下步骤：

(1)设计并合成多重PCR扩增引物，其包含ABO抗原基因特异性序列和通用接头序列；

(2)制备人基因组DNA；

(3)两组多重PCR反应扩增人基因组DNA中ABO抗原基因1-7号外显子序列；

(4)将步骤(3)得到的扩增产物进行双酶切纯化；

(5)提供寡核苷酸测序引物，将步骤(4)得到的双酶切纯化产物进行测序PCR反应；

(6)将步骤(5)得到的测序产物进行醋酸钠-乙醇沉淀法纯化，并进行毛细管电泳测序；