[发明专利]一种基于eDNA的鱼类多样性的定量方法及其采样过滤装置

摘要

本发明公开了一种基于eDNA的鱼类多样性的定量方法及其采样过滤装置，属于鱼类多样性研究领域。本发明采用过滤法进行样品DNA提取，采用的一种基于eDNA的鱼类多样性的定量采样过滤装置，在多次抽滤的同时进行搅拌，大大缩短了实验的周期，同时也可有效避免样品在实验阶段被交叉污染，过滤的样品在24h内进行DNA提取，可有效减少DNA降解，采用人体组织和血液提取物作为提取剂，可以获得最大提取量，并且提取的DNA浓度和纯度都较高，采用DNA克隆测序，可以减少实验成本，并且采用绝对定量PCR的方法进行鱼类定量研究，绝对定量可以通过标准曲线和溶解曲线来确定样本中基因的拷贝数或浓度，特异性高、准确度好。

主权项

1.一种基于eDNA的鱼类多样性的定量方法及其采样过滤装置，其特征在于，包括以下步骤：S1、使用已灭菌的采样瓶，选取水生生物保护湖流的水库及其上下游进行多次采样采集1L样品，每隔一公里设置一个采样点，每个采样点设置3个平行样，每次采样时间间隔6个月；S2、使用已灭菌的一种基于eDNA的鱼类多样性的定量采样过滤装置对采集到的样品进行过滤，过滤结束取下微孔滤膜，将微孔滤膜放置于‑20℃的冰箱中进行冷冻保存；S3、取出微孔滤膜并放置在液氮研钵中碾碎，将碎屑倒入2mL的离心管中保存备用；S4、取出样品滤膜的碎屑，采用DNA提取试剂对滤膜碎屑样品进行DNA提取实验；S5、将提取到的DNA样品放入超微量分光光度计中进行检测，分析样品DNA的浓度；S6、选择覆盖物种最多且鉴别精度最高的通用引物，使用引物进行多样性PCR扩增，扩增产物采用DNA试剂纯化回收，DNA纯化过程中进行多次洗脱，将纯化后的DNA放置于4℃冰箱中进行冷藏保存；S7、构建克隆测序文库，对PCR扩增后的DNA片段进行基因检测，将检测出的基因序列结果与NCBI数据库的基因序列进行比对，分析水体中鱼类的多样性；S8、根据基因序列对比分析结果，进行扩增后，再使用RealtimePCR的方法对样品进行扩增，进行鱼类定量研究实验。