[发明专利]一种基于eDNA的鱼类多样性的定量方法及其采样过滤装置

说明书

本发明公开了一种基于eDNA的鱼类多样性的定量方法及其采样过滤装置，属于鱼类多样性研究领域。本发明采用过滤法进行样品DNA提取，采用的一种基于eDNA的鱼类多样性的定量采样过滤装置，在多次抽滤的同时进行搅拌，大大缩短了实验的周期，同时也可有效避免样品在实验阶段被交叉污染，过滤的样品在24h内进行DNA提取，可有效减少DNA降解，采用人体组织和血液提取物作为提取剂，可以获得最大提取量，并且提取的DNA浓度和纯度都较高，采用DNA克隆测序，可以减少实验成本，并且采用绝对定量PCR的方法进行鱼类定量研究，绝对定量可以通过标准曲线和溶解曲线来确定样本中基因的拷贝数或浓度，特异性高、准确度好。

技术领域

本发明涉及鱼类多样性研究领域，尤其涉及一种基于eDNA的鱼类多样性的定量方法及其采样过滤装置。

背景技术

鱼类作为水生生态系统中最高营养级，能反映水生生态系统的生产力和生物多样性水平。传统的鱼类调查的调查手段包括走访统计，随机捕捞以及电鱼等方法。但是，这些调查方法对较大的流域进行调查，往往要花费研究人员数月甚至几年的时间进行捕获，鱼类鉴定分类，不具时效性。此外，捕捞法通常会采用电鱼的方式，但是电流的大小很难控制，部分捕获过程中为了增加实验的可靠性，导致许多鱼类被电死，对生态系统造成重大伤害。近年来，水声法渐渐被用于鱼类调查和渔业管理，水声法可以做到环境友好的，高效的探测鱼类的种群数量、密度等。但是水声法在不同环境中的准确性变化较大，在精确的科学研究中可信度较低，且难以探测出鱼类的种类的技术瓶颈长时间以来未得到解决。

随着第二代基因检测技术的发展，eDNA技术在鱼类多样性调查研究中的优势愈发明显，eDNA技术被称为“一杯水的对话”。随着对NGSmetaboarding技术研究的深入，研究人员同时利用垂钓、拖网、刺网等9种不同的采样方式进行鱼类多样性调查，发现在10种调查方法中，eDNA技术能够检出的物种最多，且eDNA比传统调查方法更为敏感，具有时效性高。

但是在目前的技术水平下，eDNA仍存在样品在非实验阶段会有交叉污染、降解等风险会影响eDNA分析结果的准确性，并且实验成本高。

发明内容

本发明的目的是为了解决eDNA仍存在样品在实验阶段会有交叉污染、降解等风险，影响eDNA分析结果的准确性和实验成本高的问题，而提出的一种基于eDNA的鱼类多样性的定量方法及其采样过滤装置。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

一种基于eDNA的鱼类多样性的定量方法及其采样过滤装置，包括以下步骤：

S1、使用已灭菌的采样瓶，选取水生生物保护湖流的水库及其上下游进行多次采样采集1L样品，每隔一公里设置一个采样点，每个采样点设置3个平行样，每次采样时间间隔6个月；

S2、使用已灭菌的一种基于eDNA的鱼类多样性的定量采样过滤装置对采集到的样品进行过滤，过滤结束取下微孔滤膜，将微孔滤膜放置于-20℃的冰箱中进行冷冻保存；

S3、取出微孔滤膜并放置在液氮研钵中碾碎，将碎屑倒入2mL的离心管中保存备用；

S4、取出样品滤膜的碎屑，采用DNA提取试剂对滤膜碎屑样品进行DNA提取实验；

S5、将提取到的DNA样品放入超微量分光光度计中进行检测，分析样品DNA的浓度；

S6、选择覆盖物种最多且鉴别精度最高的通用引物，使用引物进行多样性PCR扩增，扩增产物采用DNA试剂纯化回收，DNA纯化过程中进行多次洗脱，将纯化后的DNA放置于4℃冰箱中进行冷藏保存；

S7、构建克隆测序文库，对PCR扩增后的DNA片段进行基因检测，将检测出的基因序列结果与NCBI数据库的基因序列进行比对，分析水体中鱼类的多样性；