[发明专利]一种靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞的制备方法及应用

摘要

本发明提供了一种靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，涉及基因工程技术领域，具体步骤包括CD19‑CAR慢病毒载体的构建，慢病毒的制备，T细胞的分离和培养与T细胞的感染和扩增。该方法对转染体系，以及细胞培养过程中所用的培养基等进行了优化。一方面提高了T细胞的转导效率，克服了转染效率不足的问题；另一方面，CAR‑T细胞对CD19阳性细胞的杀伤能力显著提高，达到了98％以上，在治疗肿瘤中显示出巨大的潜力。

主权项

1.一种靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）CD19‑CAR慢病毒载体的构建在靶向CD19的嵌合抗原受体基因序列两端添加酶切位点，与慢病毒表达载体Plv‑EF1a双酶切，回收DNA片段、连接、转化、挑取单克隆、提取质粒，经过酶切电泳和测序鉴定，得CD19‑CAR慢病毒载体Plv‑EF1a‑CD19ScFv；所述的靶向CD19的嵌合抗原受体基因由CD19的单链抗体CD19ScFv、CD8的铰链区和跨膜区、CD28的胞内信号结构域、4‑1BB的胞内信号结构域以及CD3ζ的胞内信号结构域串联构成，其碱基序列如SEQ ID NO:2所示；CD19的单链抗体CD19ScFv序列由鼠抗人CD19抗体克隆FMC63的重链和轻链可变区序列经过密码子优化而得，其碱基序列如SEQ ID NO:1所示；（2）慢病毒的制备提取慢病毒表达质粒Plv‑EF1a‑CD19ScFv或慢病毒骨架质粒Plv‑EF1a，辅助质粒psPAX2和pMD2.G以6‑8:5:3的质量比混合，测定质粒浓度，与LipoFilter转染试剂以及无血清培养液配制转染体系，转染HEK293T/17细胞，收获培养上清并离心得慢病毒浓缩液；所述无血清培养基包括：无血清DMEM、15mg/L的硫酸葡聚糖、1.0mM的丙酮酸钠和15mM的4‑羟乙基哌嗪乙磺酸；（3）T细胞的分离和培养取健康外周血，分离淋巴细胞，用培养液1重悬，接种于CD3和CD28抗体包被的培养板中刺激培养24‑48h；所述的培养液1是在X‑VIVO15培养基中加入了1ng/mL的PHA和2%体积的自体血浆；（4）T细胞的感染和扩增将步骤（3）刺激培养的T细胞接种到RetroNectin包被培养板中，每孔2×10⁶个的细胞数，加入步骤（2）的慢病毒浓缩液和polybrene，37℃，饱和湿度为5％的CO₂孵箱中感染8‑12h后，更换新鲜培养液2，培养7‑10天，获得靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞；所述的培养液2是在X‑VIVO15培养基中加入了2%体积的自体血浆。