[发明专利]一种靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞的制备方法及应用

说明书

本发明提供了一种靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，涉及基因工程技术领域，具体步骤包括CD19‑CAR慢病毒载体的构建，慢病毒的制备，T细胞的分离和培养与T细胞的感染和扩增。该方法对转染体系，以及细胞培养过程中所用的培养基等进行了优化。一方面提高了T细胞的转导效率，克服了转染效率不足的问题；另一方面，CAR‑T细胞对CD19阳性细胞的杀伤能力显著提高，达到了98％以上，在治疗肿瘤中显示出巨大的潜力。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞的制备方法及应用。

背景技术

B细胞恶性肿瘤是血液系统一组恶性异质性疾病，包括急性和慢性B淋巴细胞白血病以及一些淋巴瘤亚型，因其复发率高、预后差，是临床较难治愈的血液系统恶性肿瘤。CD19作为B细胞系特异的细胞表面分化抗原，不仅表达于正常前B细胞和成熟B细胞表面，也广泛表达在多种B细胞恶性肿瘤细胞表面，而在造血干细胞、浆细胞和其他正常组织细胞中不表达，血液中也未曾检测到CD19可溶性蛋白的存在。此外，CD19分子在膜上的分布比较暴露，易与单克隆抗体结合，且结合后无显著内化、脱落以及抗原调变的发生，因此它被认为是治疗B细胞肿瘤的一个理想靶点。

嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor)，是人工合成的T细胞受体，结构上是由胞外靶向连接区以及T细胞的激活信号结构域(铰链区、跨膜区、胞内信号转导区)组成。嵌合抗原受体T细胞是最具前景的肿瘤细胞免疫治疗方式之一。通过将患者的T细胞“重编码”，使其可以特异性识别肿瘤相关抗原靶点，识别结合后将激活增殖T细胞的信号传递至细胞内，引起T细胞激活和增殖，从而有效杀伤肿瘤细胞。通过这种靶向治疗可以有效治疗肿瘤甚至达到治愈的效果。相比于传统的治疗方法，CAR-T治疗展现出巨大的优势，如对肿瘤的特异性杀伤，只要表达它所针对的靶点就能杀伤，杀瘤范围广，并且对转移性和复发性肿瘤都有效。

虽然CAR-T治疗在临床上取得了很好的疗效，尤其是靶向CD19的CAR-T治疗更是使CD19阳性的淋巴细胞白血病患者达到90％的缓解率，但是CAR-T细胞的制备过程中所涉及到的步骤和细节很多，如T细胞的活化，转染以及扩增等等，任何环节的不足都是限制CAR-T细胞广泛开展和应用的主要因素，目前尚未在体内比较第二代和第三代CAR的报道，两代CAR之间的差异可能不止来自于信号传导域，胞外的抗原结合域(scFv)、重组T细胞的转染方法、重组T细胞的回输方式等均可能影响CAR-T细胞的最终抗肿瘤效果。CN106754725A公开了一种嵌合抗原受体T细胞及其制备方法与应用，制备方法并没有优化，靶细胞的杀伤率仅在75％左右，CAR-T细胞的活化能力不强。因此，本领域亟需开发和优化CAR-T的制备方法，促使细胞扩增，提高肿瘤细胞杀伤效率。

发明内容

本发明的目的在于提供一种靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞的制备方法及应用，提高CAR-T细胞治疗中T细胞活化能力，克服转染效率不足的问题，对CD19的杀伤能力强。

本发明一方面提供了一种靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，包括如下步骤：

(1)CD19-CAR慢病毒载体的构建

在靶向CD19的嵌合抗原受体基因序列两端添加酶切位点，与慢病毒表达载体Plv-EF1a双酶切，回收DNA片段、连接、转化、挑取单克隆、提取质粒，经过酶切电泳和测序鉴定，得CD19-CAR慢病毒载体Plv-EF1a-CD19ScFv；

所述的靶向CD19的嵌合抗原受体基因由CD19的单链抗体CD19ScFv、CD8的铰链区和跨膜区、CD28的胞内信号结构域、4-1BB的胞内信号结构域以及CD3ζ的胞内信号结构域串联构成，其碱基序列如SEQ ID NO:2所示；

CD19的单链抗体CD19ScFv序列由鼠抗人CD19抗体克隆FMC63的重链和轻链可变区序列经过密码子优化而得，其碱基序列如SEQ ID NO:1所示；