[发明专利]一种靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞的制备方法及应用

权利要求书

1.一种靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）CD19-CAR慢病毒载体的构建

在靶向CD19的嵌合抗原受体基因序列两端添加酶切位点，与慢病毒表达载体Plv-EF1a双酶切，回收DNA片段、连接、转化、挑取单克隆、提取质粒，经过酶切电泳和测序鉴定，得CD19-CAR慢病毒载体Plv-EF1a-CD19ScFv；

所述的靶向CD19的嵌合抗原受体基因由CD19的单链抗体CD19ScFv、CD8的铰链区和跨膜区、CD28的胞内信号结构域、4-1BB的胞内信号结构域以及CD3ζ的胞内信号结构域串联构成，其碱基序列如SEQ ID NO:2所示；

CD19的单链抗体CD19ScFv序列由鼠抗人CD19抗体克隆FMC63的重链和轻链可变区序列经过密码子优化而得，其碱基序列如SEQ ID NO:1所示；

（2）慢病毒的制备

提取慢病毒表达质粒Plv-EF1a-CD19ScFv或慢病毒骨架质粒Plv-EF1a，辅助质粒psPAX2和pMD2.G以6-8:5:3的质量比混合，测定质粒浓度，与LipoFilter转染试剂以及无血清培养液配制转染体系，转染HEK293T/17细胞，收获培养上清并离心得慢病毒浓缩液；

所述无血清培养基包括：无血清DMEM、15mg/L的硫酸葡聚糖、1.0mM的丙酮酸钠和15mM的4-羟乙基哌嗪乙磺酸；

（3）T细胞的分离和培养

取健康外周血，分离淋巴细胞，用培养液1重悬，接种于CD3和CD28抗体包被的培养板中刺激培养24-48h；

所述的培养液1是在X-VIVO15培养基中加入了1ng/mL的PHA和2%体积的自体血浆；

（4）T细胞的感染和扩增

将步骤（3）刺激培养的T细胞接种到RetroNectin包被培养板中，每孔2×10⁶个的细胞数，加入步骤（2）的慢病毒浓缩液和polybrene，37℃，饱和湿度为5％的CO₂孵箱中感染8-12h后，更换新鲜培养液2，培养7-10天，获得靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞；

所述的培养液2是在X-VIVO15培养基中加入了2%体积的自体血浆。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：

步骤（1）中所述的酶切位点是BamH1和Sal1。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：

步骤（2）中所述的慢病毒表达质粒Plv-EF1a-CD19ScFv或慢病毒骨架质粒Plv-EF1a，辅助质粒psPAX2和pMD2.G的质量比为8:5:3。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：

在步骤（4）所述的培养板中补充终浓度为500U/mL的重组人白介素2，30ng/mL的重组人白介素7和30ng/mL的重组人白介素15。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：

所述步骤（2）的具体步骤为：

取细胞状态良好的HEK293T/17细胞，接种于培养皿中，细胞数量是24h后细胞融合度为80％，用含10％FBS的DMEM高糖培养液培养；

24h后，将表达质粒Plv-EF1a或Plv-EF1a-CD19ScFv和辅助质粒psPAX2和pMD2.G以8:5:3的质量比与LipoFilter转染试剂以及无血清培养液配制转染体系，孵育15min后共转染HEK293T/17细胞，12h更换新鲜培养液；

分别在转染换液后24h，48h时收集病毒上清，4℃，3000rpm离心15min，病毒上清用4.5μm滤器过滤，过滤后的病毒上清液转入到超速离心管中，4℃，20000rpm离心2h，弃掉上清，沉淀用无血清培养液按1:50的比例重悬，得慢病毒浓缩液。