[发明专利]一种25-羟基维生素D3的抗体制备方法

摘要

本发明公开了一种25‑羟基维生素D3的抗体制备方法，包括人工抗原制备、动物免疫及脾细胞制备、骨髓瘤细胞的制备、饲养细胞的制备、细胞融合、杂交瘤细胞筛选和亚克隆、25‑羟基维生素D3单克隆抗体纯化等步骤，由于25‑羟基维生素D3本身的分子量太小，不具有免疫原性，本发明将25‑羟基维生素D3偶联卵清白蛋白获得25‑羟基维生素D3人工抗原，所制备的25‑羟基维生素D3单克隆抗体具有效价高、亲和力好，与25‑羟基维生素D3抗原结合力强等优点，可用于免疫荧光、酶联免疫或磁微粒免疫技术等来定性或定量检测人体中25‑羟基维生素D3表达水平，临床辅助预防及治疗佝偻病、骨软化病和婴儿手足搐搦症。

主权项

1.一种25‑羟基维生素D3的抗体制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)25‑羟基维生素D3人工抗原制备：将25‑羟基维生素D3蛋白与N,N二甲基酰胺混合均匀后，加入三乙胺，混合均匀后，4℃反应，加入氯甲酸异丁酯，混匀4℃反应，得到活化的25‑羟基维生素D3蛋白；将OVA溶于超纯水中，通过氢氧化钠调整pH至8.5，加入N,N二甲基酰胺，混合均匀后，4℃反应，得到活化的卵清白蛋白；将活化的25‑羟基维生素D3蛋白与活化的卵清白蛋白混合4℃反应，反应完成后先用PBS缓冲液透析，重复2次，再用超纯水透析，重复2次，即得25‑羟基维生素D3人工抗原；(2)动物免疫及脾细胞制备：采用BALB/c小鼠，将25‑羟基维生素D3人工抗原与弗氏完全佐剂等体积混匀，皮下多点注射小鼠，间隔3周，将25‑羟基维生素D3人工抗原与弗氏不完全佐剂等体积混匀，皮下多点注射小鼠，间隔3周进行抗原冲击，25‑羟基维生素D3人工抗原尾静脉注射，3天后，取效价高小鼠的免疫脾细胞，将免疫脾细胞重悬于培养液中；(3)骨髓瘤细胞的制备：骨髓瘤细胞在含10％胎牛血清的完全RPMI1640培养液中进行培养，融合前1天，进行细胞换液并使细胞在融合当天为对数生长阶段；(4)饲养细胞的制备：细胞融合前4天，处死未免疫的8周龄KM雌性小鼠，消毒后在无菌的条件下，取小鼠腹腔细胞，即饲养细胞，用HAT培养基将沉淀饲养细胞悬浮，将上述饲养细胞悬液加入96孔板，放置37℃、5％CO2培养箱中培养备用；(5)细胞融合：将免疫脾细胞与骨髓瘤细胞混合，放入融合管中，离心机离心，弃上清；将1mL 50％PEG4000沿转动的管壁滴入，60s内加完，在5min内加入25mL DMEM培养基，终止反应，离心机离心，弃上清，加入HAT培养基，轻轻吹打使沉淀细胞悬浮；将细胞悬液加入已铺有饲养细胞的96孔板中，置37℃、含5％CO2的培养箱中培养，融合后第7天每孔用HAT完全培养液半换液，融合后第14天用HT完全培养基半换液，融合后第21天用RPMI‑1640完全培养液换液；(6)细胞筛选：融合细胞长至孔底1/10面积时，用碳酸盐缓冲液将25‑羟基维生素D3人工抗原稀释为5ug/ml，加入酶标板孔中，4℃过夜，弃去孔内液体，磷酸盐缓冲液清洗2次，每孔加封闭液4℃过夜，经洗涤液洗涤后，加入待检杂交瘤细胞培养上清，孵育，经洗涤液洗涤后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG，孵育，再经洗涤液洗涤后，加入含3％H2O2的邻苯二胺底物液显色，以H2SO4终止反应，读取OD值，选择OD值比阴性对照高5‑10倍的杂交瘤细胞再克隆化，并进行扩增冻存；(7)亚克隆：采用软琼脂法对杂交瘤细胞进行亚克隆，克隆数次，直至到100％细胞阳性率，最终得到高特异性25‑羟基维生素D3杂交瘤细胞株；(8)抗体纯化：将上述高特异性25‑羟基维生素D3杂交瘤细胞株扩增培养，待细胞浓度达105/ml以上时停止加液，再持续培养直至细胞培养液变黄后收集培养液，离心机离心，上清液经滤膜过滤后，将过滤后的上清液置于protein‑A亲合层析柱中，用磷酸盐缓冲液洗涤层析柱去除杂蛋白，再以5倍柱体积的甘氨酸溶液洗脱被吸附的抗体蛋白，并加入Tris溶液中和甘氨酸，使pH为7.2，再以10倍柱体积的磷酸盐缓冲液透析16小时后，透析后的样品再经滤膜过滤后即获得纯化的25‑羟基维生素D3单克隆抗体。