[发明专利]一种分泌烟酸的突变耻垢分枝杆菌及其构建方法

摘要

本发明提供了一种分泌烟酸的突变耻垢分枝杆菌的构建方法，包括步骤：1).构建质粒pMHS‑NrtRms；2).构建质粒pHAGE‑NrtRms；3).制备重组TM4噬菌体；4).构建nrtRms基因缺失菌株耻垢分枝杆菌mc2100。本发明的有益效果是：通过构建nrtRms基因缺失菌株耻垢分枝杆菌，使该菌株能够直接制备烟酸而不依赖于添加3‑氰基吡啶和酶催化，不仅避免了现有烟酸化学合成过程中的各种缺点，而且生产条件简单，无污染，简便易行，易放大，成本低，适合于大规模工业化生产应用，有很大的推广应用的价值。

主权项

1.一种分泌烟酸的突变耻垢分枝杆菌的构建方法，包括步骤：1).构建质粒pMHS‑NrtRms：1‑1).以耻垢分枝杆菌mc2155基因组DNA为模板、SEQ ID №1～4所示的引物对进行PCR扩增，得到如SEQ ID №5和6所示的DNA片段，电泳分离后经Van91I限制性内切酶酶切备用；1‑2).将含有pMHS质粒的大肠杆菌DH5α菌株扩大培养，然后收集菌体，抽提质粒，质粒经Van91I限制性内切酶酶切后电泳分离，回收1600bp区间和3600bp区间的DNA片段；1‑3).将步骤1‑1与1‑2所获得的DNA片段经T4 DNA连接酶16℃反应过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，抽提质粒后获得质粒pMHS‑NrtRms；2).构建质粒pHAGE‑NrtRms：2‑1).分别扩大培养含有质粒pHAGE和质粒pMHS‑NrtRms的大肠杆菌DH5α菌株，抽提质粒，两个质粒经PacI限制性内切酶线性化后再用T4 DNA连接酶16℃反应过夜，连接产物使用包装试剂盒包装并转化大肠杆菌HB101感受态细胞，抽提质粒后获得质粒pHAGE‑NrtRms；3).制备重组TM4噬菌体：3‑1).扩大培养耻垢分枝杆菌mc2155，振荡培养至对数生长期，离心收集菌体，用预冷的10％无菌甘油洗涤菌体，然后加入预冷的10％的甘油重悬菌体，‑80℃冻存备用；3‑2).将质粒pHAGE‑NrtRms转入耻垢分枝杆菌mc2155电转感受态细胞中，冰上孵育10min，然后电击转化，转化后加入7H9液体培养基，37℃培养箱孵育过夜，将37℃放置后的菌液加到含有top agar的EP管中混匀并倾倒平铺在7H10固体平板上，平板置30℃培养箱培养2‑3天，获得重组TM4噬菌体；4).构建nrtRms基因缺失菌株耻垢分枝杆菌mc2100：4‑1)7H9液体培养基培养耻垢分枝杆菌mc2155至对数生长期，离心收集菌体，用MP buffer洗涤离心获得的菌体，然后用MP buffer重悬菌体，将重悬的耻垢分枝杆菌mc2155与滴度为1010PFU的重组TM4噬菌体1:1体积混合后培养箱孵育，然后离心收集菌体弃上清后用7H9液体培养基重悬，放置培养箱孵育过夜，再次离心收集菌体弃上清，菌体涂布7H10固体平板培养，获得分泌烟酸的突变耻垢分枝杆菌mc2100。