[发明专利]一种分泌烟酸的突变耻垢分枝杆菌及其构建方法

权利要求书

1.一种分泌烟酸的突变耻垢分枝杆菌的构建方法，包括步骤：

1).构建质粒pMHS-NrtR_ms：

1-1).以耻垢分枝杆菌mc²155基因组DNA为模板、SEQ ID No.1～4所示的引物对进行PCR扩增，得到如SEQ ID No.5和6所示的DNA片段，电泳分离后经Van91I限制性内切酶酶切备用；

1-2).将含有pMHS质粒的大肠杆菌DH5α菌株扩大培养，然后收集菌体，抽提质粒，质粒经Van91I限制性内切酶酶切后电泳分离，回收1600bp区间和3600bp区间的DNA片段；

1-3).将步骤1-1)与1-2)所获得的DNA片段经T4 DNA连接酶16℃反应过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，扩大培养，抽提质粒后获得质粒pMHS-NrtR_ms；

2).构建质粒pHAGE-NrtR_ms：

2-1).分别扩大培养含有质粒pHAGE和质粒pMHS-NrtR_ms的大肠杆菌DH5α菌株，抽提质粒，两个质粒经PacI限制性内切酶线性化后再用T4 DNA连接酶16℃反应过夜，连接产物使用包装试剂盒包装并转化大肠杆菌HB101感受态细胞，抽提质粒后获得质粒pHAGE-NrtR_ms；

3).制备重组TM4噬菌体：

3-1).扩大培养耻垢分枝杆菌mc²155，振荡培养至对数生长期，离心收集菌体，用预冷的10％无菌甘油洗涤菌体，然后加入预冷的10％的甘油重悬菌体，-80℃冻存备用；

3-2).将质粒pHAGE-NrtR_ms转入耻垢分枝杆菌mc²155电转感受态细胞中，冰上孵育10min，然后电击转化，转化后加入7H9液体培养基，37℃培养箱孵育过夜，将37℃放置后的菌液加到含有top agar的EP管中混匀并倾倒平铺在7H10固体平板上，平板置30℃培养箱培养2-3天，获得重组TM4噬菌体；

4).构建nrtR_ms基因缺失菌株耻垢分枝杆菌mc²100：

4-1)7H9液体培养基培养耻垢分枝杆菌mc²155至对数生长期，离心收集菌体，用MPbuffer洗涤离心获得的菌体，然后用MP buffer重悬菌体，将重悬的耻垢分枝杆菌mc²155与滴度为10¹⁰PFU的重组TM4噬菌体1:1体积混合后培养箱孵育，然后离心收集菌体弃上清后用7H9液体培养基重悬，放置培养箱孵育过夜，再次离心收集菌体弃上清，菌体涂布7H10固体平板培养，获得分泌烟酸的突变耻垢分枝杆菌mc²100。

2.根据权利要求1所述的分泌烟酸的突变耻垢分枝杆菌的构建方法，其特征在于：步骤3)中收集菌体的离心条件为4℃，5000rpm离心10min；步骤4)中收集菌体的离心条件为6000rpm离心10min。

3.根据权利要求1所述的分泌烟酸的突变耻垢分枝杆菌的构建方法，其特征在于：步骤1-2)中的扩大培养是将菌株接种至含有150μg/mL潮霉素B的LB液体培养基，37℃过夜培养。

4.根据权利要求1所述的分泌烟酸的突变耻垢分枝杆菌的构建方法，其特征在于：步骤1-3)中的扩大培养是将菌株接种至含有150μg/mL潮霉素B的LB固体平板培养基，37℃过夜培养，然后挑取平板上长出的单克隆菌落接种至含有150μg/mL潮霉素B的LB液体培养基，37℃摇床200rpm震荡过夜培养。

5.根据权利要求1所述的分泌烟酸的突变耻垢分枝杆菌的构建方法，其特征在于：步骤2-1)中质粒pHAGE以含有氨苄抗性的LB培养基扩大培养，质粒pMHS-NrtR_ms以含有潮霉素B抗性的LB培养基扩大培养。