[发明专利]一种分泌烟酸的突变耻垢分枝杆菌及其构建方法

说明书

本发明提供了一种分泌烟酸的突变耻垢分枝杆菌的构建方法，包括步骤：1).构建质粒pMHS‑NrtR_ms；2).构建质粒pHAGE‑NrtR_ms；3).制备重组TM4噬菌体；4).构建nrtR_ms基因缺失菌株耻垢分枝杆菌mc²100。本发明的有益效果是：通过构建nrtR_ms基因缺失菌株耻垢分枝杆菌，使该菌株能够直接制备烟酸而不依赖于添加3‑氰基吡啶和酶催化，不仅避免了现有烟酸化学合成过程中的各种缺点，而且生产条件简单，无污染，简便易行，易放大，成本低，适合于大规模工业化生产应用，有很大的推广应用的价值。

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域。

背景技术

烟酸即3-吡啶甲酸，也称作为维生素B3，一种水溶性维生素，属于维生素B族，人体必需的13种维生素之一。烟酸是机体组织中重要的递氢体和抗糙皮病的因子，有维持皮肤和神经健康，促进消化的作用。若其缺乏时，可产生糙皮病，表现为皮炎、舌炎、口咽、腹泻及烦躁、失眠感觉异常等症状。与烟酰胺统称维生素PP，用于抗糙皮病，亦可用作血扩张药。作为医药中间体，用于异烟肼、烟酰胺、尼可刹及烟酸肌醇酯等的生产。现烟酸也用于粮食制品，肉品添加剂和饲料添加剂以预防糙皮病。特别是饲料中添加烟酸后可提高畜禽的抗病能力，加快生长速度，提高饲料的利用率，可大量节省饲料，降低饲养成本。美国曾喂养添加烟酸饲料的奶牛与对照组相比，产奶量可提高15％-20％。另外烟酸还可作为形成活性污泥的生化激素、空气和废气的除臭剂。烟酸在染料工业、感光材料工业、染发助剂、洗涤剂等方面也有一定的应用。

烟酸的生产目前工业上应用的主要为化学法，合成方法主要有液相法(高锰酸钾氧化法和硝酸氧化法)和气相法(臭氧氧化法、氨氧化法和空气氧化法)，所用原料主要为3-甲基吡啶、2-甲基-5-乙基吡啶、3-氰基吡啶以及哇琳等。目前最常用的方法是以3-甲基吡啶为原料空气氧化法合成烟酸。将3-甲基吡啶、空气和氨气按比例通入流化床反应器中，在290～360℃、V₂O₅催化下反应生成烟腈；再于氢氧化钠水溶液中、160℃下高压水解生成烟酸钠，最后用盐酸酸化得烟酸。在这个合成过程中需要经过烟腈这一部中间产物，烟腈水解为烟酸需要高温高压、强酸强碱，对设备具有一定的要求而且也会腐蚀设备，且对环境也不友好。中国专利CN 114288A报道了用3-甲基吡啶一步催化生成烟酸，其过程为将3-甲基吡啶与硫酸反应生成甲基吡啶硫酸盐，然后在氧化剂硝酸的作用下氧化生成烟酸硫酸盐，烟酸硫酸盐加入碱溶液中和制得烟酸，原料收率为90％左右。此过程中需要硫酸、硝酸、碱溶液等强酸强碱物质，污染严重。

在烟酸化学合成过程中，必须具备特定的高温高压环境或者采用强酸、强碱或化学催化剂处理，反应选择性不高，副产物多，产品的收率不高，环境污染大。相对而言，生物法制备烟酸具有底物选择性高、催化效率高、反应条件温和、环境污染小等特点。此外，生物法制备易放大，成本低，适合于大规模工业化生产应用。目前有报道用微生物枯草芽孢杆菌、玫瑰色红球菌、诺卡氏菌、茄病镰刀菌以及恶臭假单胞菌发酵来生物催化3-氰基吡啶制备烟酸。生物催化法制备烟酸主要是依赖于微生物发酵产腈水解酶通过此酶来催化3-氰基吡啶转化为烟酸。但无报道直接用微生物菌株来制备烟酸而不依赖于添加3-氰基吡啶和酶催化。

发明内容

本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一株新的菌株直接分泌烟酸到培养基中并从培养基中分离烟酸。

本发明所采取的技术方案是：

公开了一种分泌烟酸的突变耻垢分枝杆菌。

同时还公开了该分泌烟酸的突变耻垢分枝杆菌的构建方法，包括步骤：

1).构建质粒pMHS-NrtR_ms：