[发明专利]一种基于锁型探针等温扩增快速检测串联重复序列的方法

摘要

本发明公开了一种基于锁型探针等温扩增快速检测串联重复序列的方法，包括以下原料与操作步骤；带有修饰的锁型探针引物、聚合酶、外切酶、连接酶、Phi29等温扩增酶、扩增引物和荧光染料等；步骤一、成环反应：在提取的基因组或其他形式还有串联重复序列的较纯DNA模板放在反应管中加入锁型探针，在金属浴上95℃反应3分钟，变性，60℃反应3分钟，退火，后按照一定比例添加成环反应体系，37℃15分钟，65℃15分钟；节省了操作成本，同比现有技术，无需进行PCR扩增、毛细管电泳等昂贵仪器的复杂操作，仅仅基于金属浴加热模块和荧光测定仪即可精确检测串联重复序列，微卫星基序10个重复以内的检测，节省了操作时间。

主权项

1.一种基于锁型探针等温扩增快速检测串联重复序列的方法，其特征在于，包括以下原料与操作步骤。带有修饰的锁型探针引物、聚合酶、外切酶、连接酶、Phi29等温扩增酶、扩增引物和荧光染料等。步骤一、成环反应：在提取的基因组或其他形式还有串联重复序列的较纯DNA模板放在反应管中加入锁型探针，在金属浴上95℃反应3分钟，变性，60℃反应3分钟，退火，后按照一定比例添加成环反应体系，37℃15分钟，65℃15分钟。步骤二、磁珠纯化：1.0×AMPure XP磁珠至上述反应管中，用移液器轻轻吹打10次,充分混匀，室温孵育5分钟，将反应管瞬时离心后，置于磁力架上静置2分钟进行磁珠的分离，待溶液澄清后,小心移除上清，避免接触并吸取磁珠，切记勿弃除磁珠。保持反应管始终置于磁力架上,加入200微升新鲜配制的80％乙醇漂洗磁珠，室温孵育30秒，小心移除上清。再用乙醇重复上一步清洗过程一遍，将反应管瞬时离心,并用移液器再次吸尽残留液体，打开反应管盖并保持反应管始终置于磁力架中，将磁珠暴露于空气中直至磁珠干燥，不要超过5分钟，切记磁珠不要干燥时间太久，造成磁珠干燥过度,影响纯化效果，将反应管从磁力架中取出，加入一定体积灭菌超纯水洗脱DNA，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打充分混匀，将反应管瞬时离心并置于磁力架中，待溶液澄清后，小心吸取上清至新的灭菌反应管中。步骤三、外切酶消化：加入外切酶组分，37℃反应20分钟，80℃变性15分钟。步骤四、等温扩增：加入基因工程改造过的快速Phi29酶反应体系，37℃反应1.5小时。步骤五、信号测定：用标准荧光测定仪程序进行荧光测定，在带有SYBR Green染料的工作液种加入之前等温扩增后的反应体系，避光2分钟后根据标准曲线进行读数确定结果。