[发明专利]一种基于锁型探针等温扩增快速检测串联重复序列的方法

说明书

本发明公开了一种基于锁型探针等温扩增快速检测串联重复序列的方法，包括以下原料与操作步骤；带有修饰的锁型探针引物、聚合酶、外切酶、连接酶、Phi29等温扩增酶、扩增引物和荧光染料等；步骤一、成环反应：在提取的基因组或其他形式还有串联重复序列的较纯DNA模板放在反应管中加入锁型探针，在金属浴上95℃反应3分钟，变性，60℃反应3分钟，退火，后按照一定比例添加成环反应体系，37℃15分钟，65℃15分钟；节省了操作成本，同比现有技术，无需进行PCR扩增、毛细管电泳等昂贵仪器的复杂操作，仅仅基于金属浴加热模块和荧光测定仪即可精确检测串联重复序列，微卫星基序10个重复以内的检测，节省了操作时间。

技术领域

本发明涉及检测串联重复序列技术领域，尤其是涉及一种基于锁型探针等温扩增快速检测串联重复序列的方法。

背景技术

1982年，Hamade等人发现了短串联重复序列( Short Tandem Repeat，STR)，或称简单重复序列(SSR)，微卫星序列(Microsatellite sequence，MS)。真核生物基因组中存在大量重复频率极高而顺序复杂性极低的串联重复序列，按重复基序的长度可将串联重复序列分为卫星DNA（基序100-300bp）、小卫星DNA（基序10-60bp）、微卫星DNA（基序1-6bp）等。短串联重复序列是由DNA复制或修复过程中DNA滑动和错配或者有丝分裂、减数分裂期姐妹染色单体不均等交换引起的，它的突变率在不同物种、同一物种的不同位点或同一位点的不同等位基因间存在很大差异。短串联重复序列的检测应用范围较为广泛，包括但不限于以下领域：医学分子诊断、法医学鉴定、细胞生物学相关分析等。

尽管串联重复序列分布于整个基因组的不同位置，但其两端序列多是保守的单拷贝序列，现有的技术基本原理都是根据这两端的序列设计一对特异引物，通过PCR技术将期间的核心串联重复序列扩增出来，利用电泳分析技术（可测荧光信号的毛细管电泳技术）就可以得到其长度的多态性。串联重复序列具有高度重复性、丰富的多态性、共显性、高度可靠性等优点，但由于其需要对所研究物种的一系列微卫星位点进行克隆和测序分析，以便设计相应的引物，这是非常费时、费力和代价昂贵的工作，没有足够的投资、人力和时间，是不可能实现的，因而给它的利用带来了一定困难。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有的缺陷，针对目前检测串联重复序列的技术，主要的问题是实验设计复杂、操作繁琐、必须借助昂贵仪器进行检测，而一些分子诊断探针的设计方法又存在探针设计困难、假阳性高的问题，无法应用于法医、临床检测，探针设计困难的原因主要是由于重复的序列会让特异性结合的引物滑动或引起分子诊断用酶的链置换活性，一些基于连接酶和等温扩增酶产生的假阳性主要是由于非特异性连接拷贝数被高活性的等温扩增酶放大的问题，提供一种基于锁型探针等温扩增快速检测串联重复序列的方法，从而解决上述问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种基于锁型探针等温扩增快速检测串联重复序列的方法，包括以下原料与操作步骤。

带有修饰的锁型探针引物、聚合酶、外切酶、连接酶、Phi29等温扩增酶、扩增引物和荧光染料等。

步骤一、成环反应：在提取的基因组或其他形式还有串联重复序列的较纯DNA模板放在反应管中加入锁型探针，在金属浴上95℃反应3分钟，变性，60℃反应3分钟，退火，后按照一定比例添加成环反应体系，37℃15分钟，65℃15分钟。