[发明专利]一种蛋白质热稳定性改造的方法及其在普鲁兰酶中的应用

摘要

本发明涉及一种蛋白质热稳定性改造的方法及其在普鲁兰酶中的应用，该方法首先建立待改造蛋白质三维模型，用分子动力学模拟计算待改造蛋白质三维模型的分子热运动，根据氨基酸的Cα碳原子的位置偏移值Pi的大小判断待改造蛋白质各部分的热稳定性，确定待改造蛋白质的不稳定结构域，通过定点变异得到待改造蛋白质的突变体，从内部和外部加固不稳定结构域，并选择合适的表达系统进行表达，得到热稳定性改善的蛋白质突变体。野生型脱支普鲁兰酶BDPulA经本发明的方法改造得到热稳定性改善的BDPulA突变体，热处理1 h和2 h后，残余酶活65.54‑88.1%、52.15‑77.27%，分别是野生型脱支普鲁兰酶BDPulA的1.29‑1.75倍、1.14‑1.67倍；其T1/2 2.0‑4.5 h，是野生型脱支普鲁兰酶BDPulA的2.0‑4.5倍。

主权项

1.一种蛋白质热稳定性改造的方法，其特征在于，待改造蛋白质同已知结构的模板蛋白质的同源性>50%，具体包括以下步骤：a）选取蛋白质家族中结构已知的、与待改造蛋白质同源性最高的蛋白质为模板蛋白质，建立待改造蛋白质的三维同源模型结构，得到待改造蛋白质三维模型；b）用分子动力学模拟计算待改造蛋白质三维模型的分子热运动，每个氨基酸的Cα碳原子从起始温度t1的玻尔兹曼平均速度开始振动，在20ns时间内逐步升温到终止温度t2，步长为Δt=0.2ps，分别记录分子动力学模拟计算的待改造蛋白质三维模型每个氨基酸的Cα碳原子的分子热运动轨迹及三维坐标，至达到温度t2的稳定状态；c）根据待改造蛋白质三维模型每个氨基酸的Cα碳原子在t1和t2时的三维坐标，用以下计算式计算每个氨基酸的Cα碳原子的位置偏移值Pi：，所述计算式中xt1、yt1、zt1分别是待改造蛋白质三维模型每个氨基酸的Cα碳原子在温度t1时的三维坐标值，xt2、yt2、zt2分别是待改造蛋白质三维模型每个氨基酸的Cα碳原子在温度t2时的三维坐标值；d）根据每个氨基酸的Cα碳原子的位置偏移值Pi的大小判断待改造蛋白质各部分的热稳定性，Pi越大，热稳定性越差；选取待改造蛋白质从t1升温至t2过程中，分子结构改变较大，即Pi值较大的区域，确定待改造蛋白质的不稳定结构域，分析造成不稳定的原因，并从结构域的内部和外部加固该区域，具体方法是：（1）在不稳定结构域内部找出距离较近，但又没有较强相互作用的氨基酸对，通过定点变异，使之产生强相互作用，如氢键、盐桥、酰胺桥，从内部加固不稳定结构域；（2）观察不稳定结构域与周围其它部分的氨基酸的关系，找出距离较近，但又没有较强相互作用的氨基酸对，通过定点变异，使之产生强相互作用，如氢键、盐桥、酰胺桥，从外部加固不稳定结构域；e）选择合适的表达系统，表达上述定点变异得到的氨基酸序列，得到热稳定性改善的蛋白质突变体。