[发明专利]一种蛋白质热稳定性改造的方法及其在普鲁兰酶中的应用

说明书

本发明涉及一种蛋白质热稳定性改造的方法及其在普鲁兰酶中的应用，该方法首先建立待改造蛋白质三维模型，用分子动力学模拟计算待改造蛋白质三维模型的分子热运动，根据氨基酸的Cα碳原子的位置偏移值Pi的大小判断待改造蛋白质各部分的热稳定性，确定待改造蛋白质的不稳定结构域，通过定点变异得到待改造蛋白质的突变体，从内部和外部加固不稳定结构域，并选择合适的表达系统进行表达，得到热稳定性改善的蛋白质突变体。野生型脱支普鲁兰酶BDPulA经本发明的方法改造得到热稳定性改善的BDPulA突变体，热处理1 h和2 h后，残余酶活65.54‑88.1%、52.15‑77.27%，分别是野生型脱支普鲁兰酶BDPulA的1.29‑1.75倍、1.14‑1.67倍；其T_1/2 2.0‑4.5 h，是野生型脱支普鲁兰酶BDPulA的2.0‑4.5倍。

技术领域

本发明涉及一种蛋白质热稳定性改造的方法及其在普鲁兰酶中的应用，通过理性设计蛋白质分子loop结构，对源自脱支芽孢杆菌的普鲁兰酶进行热稳定性改造，结合蛋白质工程定点突变和异源表达技术提高普鲁兰酶的热稳定性，属于生物工程技术领域。

背景技术

酶作为天然的生物催化剂，具有较高的催化效率和底物特异性。酶的催化反应是一个动态的过程，酶分子也是一个整体稳定、局部柔韧的动态体系。无规则回路（loop）是蛋白质三维结构中的二级结构单元，是蛋白质结构中最复杂和最活跃的部分，对蛋白质的稳定性、柔韧性和动态活性起重要作用。许多酶分子的催化活性中心氨基酸位于loop上，以α-淀粉酶为例，位于催化活性中心的Asp328悬挂在19个残基组成的loop上。该loop由15个Hp-π键和两个氢键支撑，其柔韧性和稳定性对α-淀粉酶的催化活性十分重要，是酶分子改造的主要对象。

普鲁兰酶（Pullulanase，EC 3.2.1.41）是能高效、专一地水解支链淀粉分支点中的α-1,6-糖苷键的一种异淀粉酶，能使支链淀粉型多糖的分支链脱离主链，形成一系列链长不一的直链淀粉。在淀粉加工、生物能源和生物基材料等领域有重要应用。普鲁兰酶一般是在淀粉糖化阶段加入，协同糖化酶糖化，可有效加速糖化过程，提高淀粉利用率和水解效率。目前商业化的糖化酶最适作用温度和pH值分别为60°C和pH4.5，要求开发应用的普鲁兰酶不但具有相似的作用温度和pH，还应当具有良好的热稳定性。自然界中的许多微生物都能产生普鲁兰酶，但普遍存在热稳定性差的问题，制约了其在工业生产中的应用。