[发明专利]一种蛋白质热稳定性改造的方法及其在普鲁兰酶中的应用

权利要求书

1.一种蛋白质热稳定性改造的方法，其特征在于，待改造蛋白质同已知结构的模板蛋白质的同源性50%，具体包括以下步骤：

a）选取蛋白质家族中结构已知的、与待改造蛋白质同源性最高的蛋白质为模板蛋白质，建立待改造蛋白质的三维同源模型结构，得到待改造蛋白质三维模型；

b）用分子动力学模拟计算待改造蛋白质三维模型的分子热运动，每个氨基酸的Cα碳原子从起始温度t₁的玻尔兹曼平均速度开始振动，在20ns时间内逐步升温到终止温度t₂，步长为Δt=0.2ps，分别记录分子动力学模拟计算的待改造蛋白质三维模型每个氨基酸的Cα碳原子的分子热运动轨迹及三维坐标，至达到温度t₂的稳定状态；

c）根据待改造蛋白质三维模型每个氨基酸的Cα碳原子在t₁和t₂时的三维坐标，用以下计算式计算每个氨基酸的Cα碳原子的位置偏移值P_i：

，

所述计算式中x_t1、y_t1、z_t1分别是待改造蛋白质三维模型每个氨基酸的Cα碳原子在温度t₁时的三维坐标值，x_t2、y_t2、z_t2分别是待改造蛋白质三维模型每个氨基酸的Cα碳原子在温度t₂时的三维坐标值；

d）根据每个氨基酸的Cα碳原子的位置偏移值Pi的大小判断待改造蛋白质各部分的热稳定性，Pi越大，热稳定性越差；选取待改造蛋白质从t₁升温至t₂过程中，分子结构改变较大，即Pi值较大的区域，确定待改造蛋白质的不稳定结构域，分析造成不稳定的原因，并从结构域的内部和外部加固该区域，具体方法是：（1）在不稳定结构域内部找出距离较近，但又没有较强相互作用的氨基酸对，通过定点变异，使之产生强相互作用，如氢键、盐桥、酰胺桥，从内部加固不稳定结构域；（2）观察不稳定结构域与周围其它部分的氨基酸的关系，找出距离较近，但又没有较强相互作用的氨基酸对，通过定点变异，使之产生强相互作用，如氢键、盐桥、酰胺桥，从外部加固不稳定结构域；

e）选择合适的表达系统，表达上述定点变异得到的氨基酸序列，得到热稳定性改善的蛋白质突变体；

所述待改造蛋白质为脱支普鲁兰酶BDPulA324，所述BDPulA324为野生型脱支普鲁兰酶BDPulA N端截断108个氨基酸后得到的蛋白质，所述模板蛋白质为2WAN，两者同源性为64%，具体包括以下步骤：

a）将待改造的BDPulA324分子同已知结构的模板蛋白质2WAN分子进行三维同源建模，得到BDPulA324三维模型；

b）利用分子动力学模拟计算BDPulA324三维模型的分子热运动，设置起始温度t₁和终止温度t₂，BDPulA324三维模型每个氨基酸的Cα碳原子从起始温度t₁的玻尔兹曼平均速度开始振动，在20ns时间内逐步升温到温度t₂，步长为Δt=0.2ps，分别记录分子动力学模拟计算BDPulA324三维模型每个氨基酸的Cα碳原子的分子热运动轨迹及三维坐标，至达到温度t₂的稳定状态；

所述起始温度t₁和所述终止温度t₂分别为300K和340K；

c）根据在t₁和t₂时BDPulA324三维模型的每个氨基酸的Cα碳原子三维坐标，用以下计算式计算每个氨基酸的Cα碳原子的位置偏移值P_i：

，

所述计算式中x_t1、y_t1、z_t1分别是BDPulA324三维模型每个氨基酸的Cα碳原子在温度t₁时的三维坐标值，x_t2、y_t2、z_t2分别是BDPulA324三维模型每个氨基酸的Cα碳原子在温度t₂时的三维坐标值；

d）根据每个氨基酸的Cα碳原子的位置偏移值Pi的大小判断BDPulA324各部分的热稳定性，Pi越大，热稳定性越差；选取BDPulA324三维模型从t₁升温至t₂过程中，分子结构改变较大，即Pi值较大的区域，确定BDPulA324的不稳定结构域，分析造成不稳定的原因，并从结构域的内部和外部加固该区域，具体方法是：（1）在不稳定结构域内部找出距离较近，但又没有较强相互作用的氨基酸对，通过定点变异，使之产生强相互作用，如氢键、盐桥、酰胺桥，从内部加固不稳定结构域；（2）观察不稳定结构域与周围其它部分的氨基酸的关系，找出距离较近，但又没有较强相互作用的氨基酸对，通过定点变异，使之产生强相互作用，如氢键、盐桥、酰胺桥，从外部加固不稳定结构域；

e）选择合适的表达系统，以野生型脱支普鲁兰酶BDPulA为模板，对上述方法分析得到的氨基酸位点进行定点变异，表达得到热稳定性改善的BDPulA突变体；

所述热稳定性改善是指蛋白质活性损失一半时所需要的时间T_1/2提高5%以上，所述T_1/2的分析检测条件为pH 4.4，温度60℃；

所述热稳定性改善是指蛋白质的残存活力提高5%以上，所述蛋白质的残存活力分析检测条件为pH 4.4，温度60℃；

所述的定点变异为单点、两点或三点相对于BDPulA氨基酸序列SEQ ID NO: 2中的氨基酸残基的取代；

所述的单点突变为：序列SEQ ID NO: 2中的第390位的缬氨酸突变成天冬酰胺，V390N，得到BDPulA突变体V390N，具有如SEQ ID NO: 4的氨基酸序列和SEQ ID NO: 3的核苷酸序列；或序列SEQ ID NO: 2中的第390位的缬氨酸突变成丝氨酸，V390S，得到BDPulA突变体V390S，具有如SEQ ID NO: 6的氨基酸序列和SEQ ID NO: 5的核苷酸序列；

所述的两点突变为：序列SEQ ID NO: 2中的第332位的天冬氨酸突变成组氨酸，序列号第398位的天冬氨酸突变成酪氨酸，D332H/D398Y，得到BDPulA突变体D332H/D398Y，具有如SEQ ID NO: 8的氨基酸序列和SEQ ID NO: 7的核苷酸序列；

所述的三点突变为：序列SEQ ID NO: 2中的第332位、第390位以及第398位协同突变为D332H/V390N/D398Y或D332H/V390S/D398Y，得到BDPulA突变体D332H/ V390N/D398Y或BDPulA突变体D332H/ V390S/D398Y；

BDPulA突变体D332H/ V390N/D398Y具有如SEQ ID NO: 10的氨基酸序列和SEQ ID NO:9的核苷酸序列；

BDPulA突变体D332H/ V390S/D398Y具有如SEQ ID NO: 12的氨基酸序列和SEQ ID NO:11的核苷酸序列。