[发明专利]一种血管内皮祖细胞的制备方法

摘要

本发明公开了一种血管内皮祖细胞的制备方法，它属于细胞制备技术领域。将两根脐动脉，用少量无血清培养液润湿，剪碎组织；组织块放入4ml胶原酶中，组织块用2ml HBSS‑buffer洗涤2遍，在1500rpm离心5分钟，弃上清；将剪碎的组织用细胞刮刀平铺于T75cm2细胞培养瓶中，做好标记；七天后再半量换液，此后均半量换液；待细胞汇合度达到80％左右时，进行传代培养；加入6mL培养基，按照1×105个/mL细胞量加入培养基进行传代培养；待传代细胞生长至80％密度时，收获细胞，进行冻存。此种方法制备简单，且内皮祖细胞取材方便，在血管再生和心脑血管疾病的细胞治疗和基因治疗中具有广阔的应用前景。

主权项

1.一种血管内皮祖细胞的制备方法，其特征在于：具体制备方法为：步骤一、在超净台中，取新鲜的脐带一根，剪成小段，10cm，浸泡在75％的医用消毒酒精中，待脐带刚皱缩即刻放入已加入庆大霉素的医用生理盐水中；步骤二、一只手用止血钳夹紧脐带的一端，另一只手用镊子不断地挤出脐带中的残留血渍，直至脐带变为白色，要求整根脐带都没有血渍；步骤三、从脐带的横切面找到2根脐动脉和1根脐静脉，动脉比较明显、突出、静脉较不明显，将脐带沿脐静脉剪开，找出2根脐动脉；步骤四、沿1根脐动脉经周围组织小心剪开，注意此间尽量不要剪到脐动脉，剥离脐动脉，用镊子轻轻扯下动脉，另一根用同样的方法扯下；步骤五、将扯下的两根脐动脉，用少量无血清培养液润湿，剪碎组织；步骤六、组织块放入4ml胶原酶中，横放入37℃摇床中，转速100r/min，孵育40min；步骤七、消化结束后，放在冰上终止反应，组织块用2ml HBSS‑buffer洗涤2遍，在1500rpm离心5分钟，弃上清；步骤八、流式管中的加入生理盐水和4％FBS进行反应，反应终止后，在1500rpm下离心5分钟，弃上清；步骤九、将剪碎的组织用细胞刮刀平铺于T75cm2细胞培养瓶中，做好标记；步骤十、将细胞培养瓶倒扣，细胞培养瓶为有通气滤膜的培养瓶，加入培养基MSCGM‑CDTMBulletKit，产品号：00190620，拧紧瓶盖放入37℃培养箱中，在5％的CO2，放置1h；步骤十一、将培养瓶正置，此时应确保培养液能覆盖住每块组织，静置培养；步骤十二、三天后观察组织块，注意动作要轻，尽量不要晃动；步骤十三、七天后再半量换液，此后均半量换液；步骤十四、待细胞汇合度达到80％左右时，进行传代培养；步骤十五、将培养液去除，用6mL生理盐水冲洗一遍，加入3mL0.25％Trypsin‑EDTA，酚红，放入37℃培养箱中，约2‑3min，待细胞变圆时，停止消化，弃去消化液，加入6mL培养基，轻轻吹打贴壁的细胞，使细胞均匀分布于溶液中，根据细胞量，按照1×105个/mL细胞量加入培养基进行传代培养；步骤十六、待传代细胞生长至80％密度时，收获细胞，进行冻存。