[发明专利]一种血管内皮祖细胞的制备方法

说明书

本发明公开了一种血管内皮祖细胞的制备方法，它属于细胞制备技术领域。将两根脐动脉，用少量无血清培养液润湿，剪碎组织；组织块放入4ml胶原酶中，组织块用2ml HBSS‑buffer洗涤2遍，在1500rpm离心5分钟，弃上清；将剪碎的组织用细胞刮刀平铺于T75cm²细胞培养瓶中，做好标记；七天后再半量换液，此后均半量换液；待细胞汇合度达到80％左右时，进行传代培养；加入6mL培养基，按照1×10⁵个/mL细胞量加入培养基进行传代培养；待传代细胞生长至80％密度时，收获细胞，进行冻存。此种方法制备简单，且内皮祖细胞取材方便，在血管再生和心脑血管疾病的细胞治疗和基因治疗中具有广阔的应用前景。

技术领域：

本发明涉及一种血管内皮祖细胞的制备方法，属细胞制备技术领域。

背景技术：

血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是近年来研究较多的一类细胞。1997年Asahara等首次从成人外周血单个核细胞中分离得至CD34⁺细胞，因其在体外可向内皮表型细胞分化，表达内皮细胞标志物并且参与血管形成，故将此命名为EPCs。EPCs也叫成血管细胞，是一种多能干细胞，具有特异性归巢于损伤区域能增殖并分化为成熟血管内皮细胞的前体细胞，缺乏成熟内皮细胞的特征性表型，不能形成管腔样结构。EPCs起源于胚外中胚层卵黄囊血岛，由位于血岛外层的造血/成血管细胞(又称原血干细胞，是造血干细胞和内皮祖细胞的共同起源)分化发育而来。

现普遍认为，EPCs与造血干细胞起源于共同的干细胞-血液血管母细胞(heman-gioblast)。尽管对EPCs的定义和来源还存在着争议，但多数研究认为，EPCs主要来源于脐静脉血、成人外周血、骨髓，外周血中的EPCs又起源于骨髓，而脐血中的EPCs起源于胎儿的肝脏。

血管新生(neovasculorization)包括两个基本过程：即血管发生(vasculogenesis)和血管生成(angiogcnesis)。血管发生是指内皮前体细胞，即成血管细胞分化成内皮细胞从头形成原始血管网的过程。血管生成是指从已存在的血管长出新毛细血管的过程。胚胎时期机体通过血管发生和血管生成两个过程形成新血管，成年后新血管生成起先被认为是由血管生成的机制所构成，由预先存在的内皮祖细胞增生和迁移所控制，但通过对外周血EPCs的观察和研究，人们对于生后新血管生成的理解有了新的认识，即不仅存在血管生成，也包括血管发生。实际上，在组织因供血障碍导致缺血缺氧的情况下，上述不同类型的血管新生都有可能发生，但可能以某种形式为主。这一理论，已在临床中得到证实，将自体干细胞植入缺血的肢体，可促进局部血管生成。

EPCs可能通过整合、融合、旁分泌等机制参与新生血管生成和内皮细胞更新，作为种子细胞在组织工程中促进组织工程骨体内血管化。骨移植后的3个基本过程是移植物血管化、骨再生及骨端融合，其中血管化是关键环节，其作用贯穿于整个移植修复过程，对骨再生与融合的方式及效果起决定作用。体外构建的组织工程骨尤其是大体积组织工程骨植人体内后必须迅速建立充分的血供，将成骨细胞前体细胞、相关因子、营养物质及其他参与骨修复的细胞带到局部微环境中，并带走新陈代谢产生的废物及坏死和分解产物，为种子细胞的生存和发展提供营养，从整体上维持有利于这一生理过程的代谢微环境。

目前，血管内皮祖细胞的研究是生物医学领域研究的热点之一。EPCs与血管新生的关系展现了其潜在的治疗价值，在缺血疾病、生物工程材料等方面有广泛的研究应用前景。

内皮祖细胞取材方便，在血管再生和心脑血管疾病的细胞治疗和基因治疗中具有广阔的应用前景。例如，利用内皮祖细胞修复心肌梗死患者的心脏，治疗临床肢体缺血，治疗冠状动脉疾病，改善血管移植物的通畅率，改善糖尿病患者的血管形成能力，定向抑制肿瘤血管生成，作为基因治疗导向载体和靶细胞，等等。应用内皮细胞治疗心血管疾病，特别是心衰，冠状动脉硬化将是很有前途的新方法。

发明内容：