[发明专利]一种耐药性大肠杆菌整合酶活性测定方法

摘要

本发明涉及生物酶活性测定技术领域，特别涉及一种耐药性大肠杆菌整合酶活性测定方法，包括：提取大肠杆菌质粒DNA；以质粒DNA为模板，PCR扩增出编码整合酶的整合子基因intI，并连接到表达载体pEASY‑E1上，再转化到大肠杆菌BL21(DE3)中；PCR扩增出含整合酶基因重组位点attI和基因盒基因重组位点attC的DNA片段，并连接到载体质粒PUC19上，再转化到大肠杆菌DH5α；实时荧光定量PCR测定发生整和作用的拷贝数和未发生作用的拷贝数，计算整合效率，得整合酶活性大小。本发明分别构建带有整合酶的整合子基因intI的载体和含整合酶基因重组位点attI和基因盒基因重组位点attC的载体，体外测定并计算整合效率的大小，从而反应出整合酶活性大小，为研究大肠杆菌的耐药性提供理论基础。

主权项

1.一种耐药性大肠杆菌整合酶活性测定方法，其特征在于，包括以下步骤：S1，提取大肠杆菌质粒DNA；S2，以S1中的质粒DNA为模板，设计特异性引物，PCR扩增出编码整合酶的整合子基因intI，并连接到表达载体pEASY-E1上，得重组载体pEASY-intI，然后将pEASY-intI转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，得到转化大肠杆菌BL21(DE3)；S3，以S1中质粒DNA为模板设计与载体质粒PUC19具有相同酶切位点和保护性碱基的特异性引物，PCR扩增出含整合酶基因重组位点attI和基因盒基因重组位点attC的DNA片段，将PCR扩增所得DNA片段连接到载体质粒PUC19上，得重组载体PUC19-attI-attC，并将载体PUC19-attI-attC转化于大肠杆菌DH5α中，得到转化大肠杆菌DH5α；S4，将S2中的转化大肠杆菌BL21(DE3)与S3中的转化大肠杆菌DH5α过夜共培养，用实时荧光定量PCR测定发生整合作用的拷贝数A和未发生整合作用的拷贝数B，按公式C＝A/(A+B)计算整合效率C；或者分别提取转化大肠杆菌BL21(DE3)和转化大肠杆菌DH5α的质粒，并在Tris-HCl、NaCl、EDTA、甘油混合反应体系中加热，用实时荧光定量PCR测定发生整合作用的拷贝数A1和未发生整合作用的拷贝数B1，按公式C1＝A1/(A1+B1)计算整合效率C1；其中，实时荧光定量PCR测定时，attI和attC位点之间间隔DNA序列为440bp则为未发生整合作用，否则为发生了整合作用；所述整合效率的数值大小表示整合酶活性大小。