[发明专利]快速检测汉赛巴尔通体的引物及制备方法和试剂盒

摘要

本发明公开了一种本发明涉及一种汉赛巴尔通体基因组DNA可视化快速检测方法的建立，属生物技术领域，筛选出1对特异性高、敏感性强的RPA引物，即上游引物<210>2和上游引物<210>2，建立了检测Bh基因组DNA的RPA检测体系。与常规PCR方法相比，RPA‑LFA具有对仪器设备要求低(只需要一个恒温水浴锅)、检测速度快(约40min)、检测结果的可视化(可以直接用肉眼观察检测结果)等优点，这些优点使得本发明建立的RPA‑LFA方法可以用于宠物医院猫Bh感染的快速检测和诊断。 1

主权项

1.一种快速检测汉赛巴尔通体的引物，其特征在于，其上游引物的基因序列为<210>2，下游引物的基因序列为<210>3。

2.根据权利要求1所述的快速检测汉赛巴尔通体的引物，其特征在于，

主要通过下列步骤制备：

Bh基因组DNA的制备，取Bh对数生长期培养物收集菌体，菌体用TE缓冲液悬浮后，用细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，测定提取DNA的浓度及纯度,待用；

Bh RPA引物的设计与合成，下载GenBank公布的Bh不同分离株gltA基因，通过Blast N和DNAMAN软件对Bh gltA基因进行序列比对，筛选高度保守的序列作为扩增的靶序列，设计若干对特异性引物，通过试验筛选出具有高特异性和敏感性的检测RPA引物；

RPA反应体系的配制及操作程序，配制RPA反应体系，进行RPA反应，

RPA最佳引物的筛选，以Bh基因组DNA为模板，分别用若干对Bh RPA引物进行RPA扩增，随后用对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据特异性、敏感性和产物量筛选出RPA最佳引物。

3.根据权利要求1或2所述的快速检测汉赛巴尔通体的引物，其特征在于，将所述的引物制备成胶体金标抗体：

采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液，向其中加入兔抗地高辛抗体IgG，恒温缓慢振荡并离心处理，弃去上清液，沉淀溶解于Tris‑HCL缓冲溶液中，得到胶体金标记的兔抗地高辛抗体IgG。

4.一种快速检测汉赛巴尔通体的试剂，其特征在于，根据权利要求1或2所述的引物制备。

5.一种快速检测汉赛巴尔通体的试剂盒，其特征在于，根据权利要求3所述的到胶体金标记的兔抗地高辛抗体IgG制备，所述试剂盒至少包含以下5个部分：加样垫、结合垫、吸收垫、NC膜和PVC塑料垫，所述的NC膜上设有检测线即T线和质控线即C线，其制备过程为：

将制备的胶体金标记兔抗地高辛抗体IgG用移液枪均匀滴加喷到NC膜上，放在真空干燥箱中干燥后取出，作为结合垫，

在NC膜上，检测线(T线)上包被经PBS缓冲液稀释的链霉亲和素，质控线上包被羊抗兔IgG，干燥，组装的顺序依次为：在PVC塑料垫的中间区域先贴上NC膜，结合垫贴在NC膜的前方区域，为保证良好的接触，结合垫压NC膜1.5‑2.5mm，再在结合垫的前方贴上样品垫，样品垫压结合垫1.5‑2.5mm，最后将吸水垫贴在NC膜的后方，吸水垫压NC膜1.5‑2.5mm，将试纸板切切割为3.5‑4.5mm的试纸条,将制备好的试纸条包装。

6.一种快速检测汉赛巴尔通体的引物及该引物的制备方法，其特征在于，主要包含下列步骤：

Bh基因组DNA的制备：取Bh对数生长期培养物于离心管，离心处理，收集菌体，弃上清，菌体用TE缓冲液悬浮后，用细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，测定提取DNA的浓度及纯度,待用；

Bh RPA引物的设计与合成：下载GenBank公布的Bh不同分离株gltA基因，通过Blast N和DNAMAN软件对Bh gltA基因进行序列比对，筛选高度保守的序列作为扩增的靶序列，参考RPA引物设计的基本原则，设计若干对特异性引物，通过试验筛选出具有高特异性和敏感性的检测RPA引物；

RPA反应：配制RPA反应体系，包括RPA‑FP、RPA‑RPL、Rehydration Buffer μL、dd H₂O、模板和MgAc，将模板和MgAc之外的所有试剂预混后，转入预添加exo冻干酶制剂的PCR反应管中，并充分混匀，将模板加入反应管中，并将MgAc加在反应管盖中，盖紧后瞬时离心并涡旋后，放入38‑42℃水浴锅中进行RPA反应35‑45min；

RPA最佳引物的筛选：以Bh基因组DNA为模板，分别用若干对Bh RPA引物进行RPA扩增，随后用对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据特异性、敏感性和产物量筛选出RPA最佳引物。