[发明专利]引物末端酶解二聚体法PCR

摘要

引物末端酶解二聚体法PCR，其特征是采用3'最末端第1/2个碱基均为A/a腺嘌呤结尾的引物和底物dUTP/dU代替dTTP渗入PCR产物酶解污染策略；尿嘧啶‑DNA糖基化酶UDG酶解引物二聚体的缺/脱dU产物仍是引物结合模板，引物对3'最末a配对PD产物链脱dU处既缺碱基可匹配结合又无模板可复制；无a结尾引物须变一个3'末端RNA(rN)碱基以增加RNase酶解PD污染；使用eUDG、及RNaseH‑II和内切酶III‑VIII、限制内切酶消化前次或历次PCR产物气雾胶、靶交叉污染，联用中部同序引物减少内源PD产生，PCR成分加蔗糖分层缓释并矿物油封闭，热启动、热灭活不耐热酶。

主权项

1.引物末端酶解二聚体法PCR，其特征是采用引物末端碱基修饰并且在PCR反应试剂混合之前进行修饰产物酶解去除污染引物二聚体的PCR技术，具体如以下方法：(1)选取3'最末端倒数第1/2个碱基或1-2个碱基均为A/a腺嘌呤结尾设计的一对引物，底物dUTP/dU代替dTTP渗入PCR产物包括引物二聚体PD产物，通过PCR试剂成分预先加入0.2-2％体积E.coli UDG(5U/μl,v/v)大肠杆菌尿嘧啶-DNA糖基化酶，各成分于混合前室温RT两小时至两天—或37℃二十分钟至两小时消化前次或历次PCR产物气雾胶交叉污染，然后依次混合所述PCR试剂并加入待测纯化样本，立即PCR反应；(2)无a结尾但离末尾小于7-8碱基或一端无a结尾一对引物均变一个3'末端RNA(rN)碱基(a之外),或一侧a结尾引物变一个3'末端rN碱基而无a结尾引物近末端变一个rN碱基，随机dU代替dT渗入PCR产物,其PCR成分预先加入0.2-2％(v/v)eUDG+0.2-2％(v/v)RNaseH/HII(5U/μl)和0.2-5‰(v/v)内切酶EndIII-VIII(10U/μl)三酶联用,成分混合前室温RT三小时至三天—或37℃半小时至三小时,彻底酶解切断PD产物污染，然后依次混合所述PCR试剂并加入待测纯化样本，尽快PCR反应；(3)最末1-2个a结尾一对引物a之外再3'端离最末小于6-10碱基处(嘧啶后面)变一个RNA(rN)碱基，底物dU代替dT渗入PCR产物，PCR成分预先加入0.5-1％(v/v)eUDG单独酶解；或PCR成分预先加入1％(v/v)eUDG和0.5％RNaseH/HII(5U/μl)先行酶解37℃一小时至三小时，Taq酶中另加0.5-1％(v/v)内切酶EndIII-VIII(10U/μl)于PCR反应液混合后37℃不超过30分钟，程序预设三酶顺次水解，然后加样、启动PCR反应。