[发明专利]引物末端酶解二聚体法PCR

说明书

引物末端酶解二聚体法PCR，其特征是采用3'最末端第1/2个碱基均为A/a腺嘌呤结尾的引物和底物dUTP/dU代替dTTP渗入PCR产物酶解污染策略；尿嘧啶‑DNA糖基化酶UDG酶解引物二聚体的缺/脱dU产物仍是引物结合模板，引物对3'最末a配对PD产物链脱dU处既缺碱基可匹配结合又无模板可复制；无a结尾引物须变一个3'末端RNA(rN)碱基以增加RNase酶解PD污染；使用eUDG、及RNaseH‑II和内切酶III‑VIII、限制内切酶消化前次或历次PCR产物气雾胶、靶交叉污染，联用中部同序引物减少内源PD产生，PCR成分加蔗糖分层缓释并矿物油封闭，热启动、热灭活不耐热酶。

技术领域：

本发明属于分子生物学及分子检验的核酸扩增PCR技术领域，具体涉及碱基修饰引物末端的酶解来限制或去除其引物二聚体PD产物非特异性污染的PCR领域。

背景技术：

多聚酶链反应PCR背景可追溯至其历史发展源头，1953年Watson建立DNA双螺旋模型及半保留复制法则为PCR扩增奠定了其分子基础，甚至1971年Khorana就已发表了一核酸体外扩增(J.Molec.Biol.,56:341)相关论文；但限于当时技术条件不足,没有产生成熟的核酸扩增技术。直到1985年美国Cetus公司Mullis根据一端引物测序原理,想到了一对引物结合延伸-指数扩增或几何级数式放大的巨大威力,才发明了一对特异引物结合、复制靶分子基因,体外(于试管内)模拟天然基因半保留复制的PCR技术；再经过一系列发展和耐热聚合酶、热循环仪的发明、应用，Cetus公司于1987年申请了首个PCR发明专利(US Patent 4,683,202)。扩增过程一般经靶DNA变性：加温94℃使双链解离成为单链；引物退火(复性)：降温至54℃左右使过量引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物延伸：升温至72℃左右，DNA单链模板—引物结合物在耐热DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，尊循碱基反向配对与半保留复制原理，引物末端按5'-3'方向延伸、合成一条新的与模板DNA链反向互补的半保留复制链，不断重复循环变性--退火--延伸三过程，这种新链又可成为下次循环的模板，靶分子以2ⁿ级数产生更多的“半保留复制”新链。

超级灵敏度的指数放大或几何级数放大是PCR最核心的本质或优点，靶分子以2ⁿ级数放大,常规30个热循环反应2³⁰约等于10⁹放大倍数,扩增放大倍数似原子裂变链式反应难以想象,也是一般线性放大检测方法无可比拟的,灵敏度远远大于普通检测方法的放大倍数,近40个循环反应放大10¹²倍或达飞克fg/ml即个位数分子水平检测。这也是PCR成为应用最广的最核心技术甚至多少个最形容也绝不过分的根本原因。同样，指数放大亦带来PCR高度特异性和顽固的非特异性，PCR特异性直接来源于引物序列的特异性,一端引物序列一点非特异错配扩增甚至仅一侧完全配对扩增也仅是线性放大,自然远远赶不上指数扩增或几何级数放大，引物特异性任何一点降低或与靶一丁点不匹配也就扩增速率落下了,而远远赶不上特异的指数或几何级数放大；反过来说,只要是靶分子以指数扩增或几何级数放大，PCR扩增检测就具有足够高特异性。非特异性同理，各种常规检验方法遇见的非特异性原因虽也存在于PCR技术,但终究赶不上指数扩增放大，仅一条引物非特异结合线性扩增远远赶不上指数非特异性,只有一对引物均非特异结合、延伸的扩增才是唯一指数非特异性原因,引物间非特异聚合并互为模板、互为引物的二聚体PrimerDimer(PD)指数扩增是PCR非特异性本质,也是其难以克服的根本原因,一般3'末端数个碱基连续反向互补的引物对于不加模板的本底PCR扩增反应中约几个—十几个循环处即出现引物二聚体PD扩增；一对常规设计的引物对于本底PCR反应30个循环开始出现显著的PD非特异性扩增，并遮盖和抑制位于30-38循环的数千拷贝数以下的低浓度靶分子扩增检测，这也是普通PCR只进行30个循环反应的主要原因。