[发明专利]引物末端酶解二聚体法PCR

权利要求书

1.引物末端酶解二聚体法PCR方法，其特征是采用引物末端碱基修饰并且在PCR反应试剂混合之前进行修饰产物酶解去除污染引物二聚体的PCR技术，具体为以下三种方法中的任意一种：

(1)选取3'最末端倒数第1/2个碱基或1-2个碱基均为A/a腺嘌呤结尾设计的一对引物，底物dUTP/dU代替dTTP渗入PCR产物包括引物二聚体产物，通过PCR试剂成分预先加入体积百分比0.2-2％的浓度为5U/μl的UDG酶，各成分于混合前室温两小时至两天或37℃二十分钟至两小时消化前次或历次PCR产物气雾胶交叉污染，然后依次混合所述PCR试剂并加入待测纯化样本，立即PCR反应；

(2)无a结尾但离3’末尾小于7-8碱基或一端无a结尾则一对引物均在a之外变一个3'末端rN碱基,或一侧a结尾引物变一个3'末端rN碱基而无a结尾引物近3'末端变一个rN碱基，随机dU代替dT渗入PCR产物，其PCR成分预先加入体积百分比0.2-2％的UDG酶，体积百分比0.2-2％的浓度为5U/μl的RNaseH/HII和体积百分比0.2-5‰的浓度为10U/μl的内切酶EndIII-VIII三酶,成分混合前室温三小时至三天或37℃半小时至三小时，彻底酶解切断引物二聚体产物污染，然后依次混合所述PCR试剂并加入待测纯化样本，尽快PCR反应；

(3)3’最末1-2个a结尾一对引物a之外再3'端离3’最末小于6-10碱基处在嘧啶后面变一个rN碱基，底物dU代替dT渗入PCR产物，PCR成分预先加入体积百分比0.5-1％的UDG酶单独酶解；或PCR成分预先加入体积百分比1％的UDG酶和0.5％浓度为5U/μl的RNaseH/HII先行酶解37℃1-3小时，Taq酶中另加体积百分比0.5-1％的浓度为10U/μl的内切酶EndIII-VIII于PCR反应液混合后37℃不超过30分钟，程序预设三酶顺次水解，然后加样、启动PCR反应。

2.根据权利要求1所述的引物末端酶解二聚体法PCR方法，其特征在于：所述上下游引物中的一条的引物中部至5'端增加变一个rN碱基、dI碱基或烷基修饰嘌呤；对应地，所有PCR试剂成分在混合前添加UDG酶,RNaseHII酶和hAAG酶，于物理隔绝情况下PCR以杜绝引物二聚体非特异性扩增。

3.根据权利要求1所述的引物末端酶解二聚体法PCR方法，其特征在于：为防止靶分子气雾胶造成微量污染试剂，PCR试剂成分/各组分混合前还加入不影响靶扩增的稀浓度0.2％-0.5％(v/v)靶序列限制内切酶2-4种混合酶液，利用PCR成分混合前室温两小时至两天或37℃二十分钟至两小时酶切消化靶模板分子交叉污染。

4.根据权利要求1所述的引物末端酶解二聚体法PCR方法，其特征在于：PCR用水使用便宜的化学法替代酶法消化污染，新鲜纯化水采用加0.1‰-0.2‰(v/v)稀释的10％次氯酸钠液室温1-2天消化污染DNA，再开盖煮沸除去次氯酸钠后加0.05‰-0.1‰(v/v)外切酶ExoIII，冷藏待用。

5.根据权利要求1所述的引物末端酶解二聚体法PCR方法，其特征在于：所述上下游引物具有中部6-8b同序/相同碱基序列的引物，用于减少引物二聚体程度/推后引物二聚体本底扩增Ct值，部分减少内源性引物二聚体扩增。

6.根据权利要求1所述的引物末端酶解二聚体法PCR方法，其特征在于：所述上下游引物中部6-8b同序并且添加一引物中部互补的反义碱基5-9b中部干扰Oligo寡核苷酸抑制剂，选择性抑制PCR反应内的内源性持续引物二聚体扩增以及消除引物二聚体本底Ct值。

7.根据权利要求1所述的引物末端酶解二聚体法PCR方法，其特征在于：在矿物油密闭PCR反应的情况下，采用含10％蔗糖的引物，结合热启动PCR以减少气雾胶的产生。

8.根据权利要求1所述的引物末端酶解二聚体法PCR方法，其特征在于：PCR反应液添加含甜菜碱和聚阴离子多聚磷酸PCR增效剂，双向增强靶扩增效率和抑制引物二聚体非特异性扩增。