[发明专利]一种检测山茶属植物细胞核DNA含量的方法

摘要

本发明提供了一种检测山茶属植物细胞核DNA含量的方法，包括如下步骤：切取山茶属植物叶片或茎段，获取外植体；对所述外植体进行消毒预处理；诱导愈伤组织；处理经诱导的愈伤组织，使其发生细胞核分离,过滤；对步骤(4)得到的滤液进行染色以制备待测细胞核裂解溶液；以及通过流式细胞仪检测所述待测细胞核裂解溶液的细胞核DNA含量。本发明的方法在山茶属植物的倍型检查、基因组大小测定等方面具有应用意义，为山茶属植物的多倍体育种提供了新的分析技术。 1

主权项

1.一种检测山茶属植物细胞核DN A含量的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)切取山茶属植物叶片或茎段，获取外植体；

(2)对所述外植体进行消毒预处理；

(3)诱导愈伤组织；

(4)处理经诱导的愈伤组织，使其发生细胞核分离,过滤；

(5)对步骤(4)得到的滤液进行染色以制备待测细胞核裂解溶液；以及

(6)通过流式细胞仪检测所述待测细胞核裂解溶液的细胞核DNA含量。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述外植体保存在4‑10℃湿润环境中。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(2)中，将外植体切成小块，进行酒精消毒预处理，之后浸泡在HgCl₂溶液中，无菌水冲洗，吹干水分；

优选地，所述小块的粒径基本上小于1cm；

优选地，所述HgCl₂溶液的质量体积比为0.1％。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(3)中，将消毒后的所述外植体，接种于愈伤组织诱导培养基中，放置于暗处培养15天，观察到诱导出细小、颗粒状愈伤组织，然后移至光强2500～3000Lx的条件下培养；

优选地，所述愈伤组织诱导培养基的组分为MS培养基、30g·L^‑1蔗糖、6.5g·L^‑1琼脂、0.5mg·L^‑12,4‑二氯苯氧乙酸、50mL·L^‑1椰子水。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述MS培养基具有如下的配方：

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(4)中，通过细胞核裂解液处理经诱导的愈伤组织,其中所述细胞核裂解液的组分为200mM Tris、4mM MgCl₂、体积比为0.5％的Triton X‑100,pH为7.5。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在步骤(4)中，通过所述细胞核裂解液处理经诱导的愈伤组织,并切碎，完全浸没于所述细胞核裂解液中，置于冰上放置15分钟，之后通过滤膜进行过滤以得到滤液；

优选地，在步骤(4)中，选取粒径为4‑6mm的经诱导的愈伤组织进行处理；

优选地，所述滤膜的孔径为40微米。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤(5)中，在步骤(4)得到的所述滤液中加入1/10体积的1mg/ml碘化丙啶溶液,混匀后置于冰上避光保存。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)选取生长状态良好的山茶属植物，切取叶片或茎段，保存在4‑10℃湿润环境中；

(2)将所述外植体切成粒径基本上小于1cm的小块,使用体积比为70％‑75％的酒精表面消毒30秒，之后使用质量体积比为0.1％的HgCl₂浸泡8分钟，无菌水冲洗5～6次，清洗完毕后将所述小块铺在含有滤纸的平皿里吹干水分；

(3)将消毒后的所述小块，接种于组分为MS培养基、30g·L^‑1蔗糖、6.5g·L^‑1琼脂、0.5mg·L^‑12,4‑二氯苯氧乙酸、50mL·L^‑1椰子水的愈伤组织诱导培养基中，放置于暗处培养15天，观察到诱导出细小、颗粒状愈伤组织，然后移至光强2500～3000Lx培养；

(4)选取5个粒径为4‑5mm的愈伤组织，置于5cm直径的塑料培养皿中，在培养皿中加入2ml细胞核裂解液；使用手术刀片，将愈伤组织轻轻切碎，并完全浸没于所述细胞核裂解液中；盖上所述培养皿，置于冰上放置15分钟，之后通过孔径为40微米的滤膜，对裂解缓冲液进行过滤以得到滤液；其中所述细胞核裂解液的组分为200mM Tris、4mMMgCl₂、体积比为0.5％的Triton X‑100,pH为7.5；

(5)将在步骤(4)得到的所述滤液中转移至2ml的塑料管中，并加入1/10体积的1mg/ml碘化丙啶溶液,轻轻晃动至液体混合以制备待测细胞核裂解溶液，置于冰上避光保存；以及

(6)将所述待测细胞核裂解溶液，置于流式细胞仪中进行检测。

10.根据权利要求1‑9任一项所述的方法在山茶属植物的倍型检查、基因组大小测定以及多倍体育种方面的应用。