[发明专利]一种FFPE组织样本的超低频建库方法

摘要

本发明公开了一种FFPE组织样本的超低频建库方法，步骤包括FFPE样本的DNA提取；DNA打断；去磷酸化与DNA变性；生物素UID单链接头的添加；链霉素磁珠捕获与洗脱；双链第二接头的添加与文库洗脱通过T4DNA连接酶，在上述靶DNA分子的另一端加上第二个接头，并洗去过剩与残留的接头；LM‑PCR扩增，引入barcode；磁珠纯化PCR扩增产物。本发明针对某些严重降解的FFPE DNA微量样本实现建库捕获测序，在建库开始前通过引入UID标签接头，从而为后续排除建库、捕获以及上机测序过程中引入的技术突变提供前提条件。

主权项

一种FFPE组织样本的超低频建库方法，其特征在于，步骤如下：步骤一、FFPE样本DNA的提取；步骤二、DNA片段化处理：确定提取的FFPE DNA样本的降解程度，根据降解程度决定是否打断；步骤三、DNA的去磷酸化与变性：使用去磷酸化酶FastAP，对DNA5’与3’端去磷酸化；步骤四、单链接头的添加：在连接酶的作用下，将单链接头与变性的单链DNA进行连接；步骤五、链霉素磁珠捕获与洗脱：利用链霉素与生物素结合的特性，使用带有链霉素的磁珠对步骤四中的连接产物进行捕获，然后变性，洗脱；步骤六、引物退火与延伸：根据单链接头的部分序列，设计引物，并在dNTP、酶条件下，进行延伸反应；步骤七、双链第二接头的添加与文库洗脱：使用连接酶将双链第二接头与延伸获得的靶双链DNA分子进行连接，使用洗脱洗去残留接头；步骤八、LM‑PCR扩增，引入barcode：使用带barcode的引物序列，进行带磁珠的PCR反应，靶向富集DNA分子；步骤九、磁珠纯化PCR扩增产物。