[发明专利]一种FFPE组织样本的超低频建库方法

权利要求书

1.一种FFPE组织样本的超低频建库方法，其特征在于，步骤如下：

步骤一、FFPE样本DNA的提取；

步骤二、DNA片段化处理：确定提取的FFPE DNA样本的降解程度，根据降解程度决定是否打断；

步骤三、DNA的去磷酸化与变性：使用去磷酸化酶FastAP，对DNA5’与3’端去磷酸化；

步骤四、单链接头的添加：在连接酶的作用下，将单链接头与变性的单链DNA进行连接；

步骤五、链霉素磁珠捕获与洗脱：利用链霉素与生物素结合的特性，使用带有链霉素的磁珠对步骤四中的连接产物进行捕获，然后变性，洗脱；

步骤六、引物退火与延伸：根据单链接头的部分序列，设计引物，并在dNTP、酶条件下，进行延伸反应；

步骤七、双链第二接头的添加与文库洗脱：使用连接酶将双链第二接头与延伸获得的靶双链DNA分子进行连接，使用洗脱洗去残留接头；

步骤八、LM-PCR扩增，引入barcode：使用带barcode的引物序列，进行带磁珠的PCR反应，靶向富集DNA分子；

步骤九、磁珠纯化PCR扩增产物。

2.根据权利要求1所述的FFPE组织样本的超低频建库方法，其特征在于：所述根据降解程度决定是否打断是指：根据凝胶电泳显示的降解程度，将提取的FFPE DNA样本分为四种类型：无降解，有主带且主带大小大于2K；轻度降解，有主带但主带范围在1K～2K之间；中度降解，无主带，条带弥散，片段范围在100bp～2kb之间；严重降解，无主带，片段大小小于500bp；严重降解的样本，无需打断，直接建库，无降解、轻度降解与中度降解的需要进行超声打断。

3.根据权利要求1所述的FFPE组织样本的超低频建库方法，其特征在于：所述步骤三中，去磷酸化反应体系为：8 ul 10x T4 RNA ligation Buffe；2 ul 2% Tween 20；1ul FastAP；x ul FFPE DNA；34.6-x ul ddH20；去磷酸化反应条件为35～39℃，6～15min，然后90～100℃变性1～5min，立即冰浴。

4.根据权利要求1所述的FFPE组织样本的超低频建库方法，其特征在于：所述步骤四中，单链接头为带有UID标签与Splinter序列的接头，其中UID标签用于标记每条单链DNA分子。

5.根据权利要求1所述的FFPE组织样本的超低频建库方法，其特征在于：所述步骤四中，连接酶为T4 DNA连接酶，连接反应的体系为：32 ul 50 % PEG-8000；0.4 ul 100 mM ATP；1 ul 单链接头；1 ul T4 DNA Ligase；45.6 ul步骤三变性产物；连接反应温度35～39℃，反应时间35～80min。

6.根据权利要求1所述的FFPE组织样本的超低频建库方法，其特征在于：所述步骤五中，使用MyOne C1磁珠，进行捕获；文库洗脱过程中，先将样本90～100℃变性处理1～10min，立即冰浴后，进行洗脱Buffer，洗去Splinter序列，弃上清。

7.根据权利要求1所述的FFPE组织样本的超低频建库方法，其特征在于：所述步骤六中，延伸反应使用48 ul Buffer回溶磁珠，Buffer体系为：39.1 ul ddH20；5 ul 10 x Klenow reaction buffer；0.4 ul 25 mM dNTP；2.5 ul 1% Tween-20 和1 ul 延伸引物100uM；引物退火条件为：65℃，2 min。

8.根据权利要求1所述的FFPE组织样本的超低频建库方法，其特征在于：所述步骤七中，连接酶为T4 DNA连接酶，进行双链第二接头的添加，连接体系为：73.5 ul ddH20；10 ul 10x T4 DNA 连接酶buffer；10 ul 50 % PEG-4000；2 ul 第二接头100uM；2.5 ul 1% Tween-20；2 ul T4 DNA 连接酶，连接条件为：15～30℃，反应时间35～80min。