[发明专利]一种FFPE组织样本的超低频建库方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种FFPE组织样本的超低频建库方法，主要解决基于NGS测序过程中，FFPE 样本的建库测序问题。

背景技术

目前FFPE样本的建库方法主要有两类：

第一类为双链DNA建库方法，该方法不足之处主要表现在以下几个方面：

1、双链DNA所需建库样本量较大，因此，无法满足临床上的某些组织样本的需要，比如穿刺组织的FFPE样本，5～10年的FFPE样本等；

2、由于在建库过程中需要多步纯化过程，因此某些较短的或者超短的DNA，单链的DNA，严重损伤的DNA均被损失，无疑给原本就珍贵的样本雪上加霜，从而造成某些超低频率的突变无法检出；

3、由于建库过程需要对某些严重降解的样本进行末端修复，PCR富集，上机测序等，这些过程均存在着引入技术突变的可能性，从而导致检测的不准确。

第二类为单链DNA建库方法，该方法的不足之处在于：

1、在单链建库过程中，单链接头与单链DNA的连接具有偏好性，连接效率比较低，导致依然需要较大的起始建库样本量；

2、在现有的单链建库中依然存在着与双链DNA建库共有的问题，那就是同样存在着无法排除因人为操作引入的突变。

发明内容

本发明目的在于解决现有技术中的上述问题，提供一种FFPE组织样本的超低频建库方法。

本发明为达到上述目的，所采用的技术手段是：一种FFPE组织样本的超低频建库方法，其步骤如下：

步骤一、FFPE样本DNA的提取；

步骤二、DNA片段化处理：确定提取的FFPE DNA样本的降解程度，根据降解程度决定是否打断；

步骤三、DNA的去磷酸化与变性：使用去磷酸化酶FastAP，对DNA5’与3’端去磷酸化；

步骤四、单链接头的添加：在连接酶的作用下，将单链接头与变性的单链DNA进行连接；

步骤五、链霉素磁珠捕获与洗脱：利用链霉素与生物素结合的特性，使用带有链霉素的磁珠对步骤四中的连接产物进行捕获，然后变性，洗脱；

步骤六、引物退火与延伸：根据单链接头的部分序列，设计引物，并在dNTP、酶条件下，进行延伸反应；

步骤七、双链第二接头的添加与文库洗脱：使用连接酶将双链第二接头与延伸获得的靶双链DNA分子进行连接，使用洗脱洗去残留接头；

步骤八、LM-PCR扩增，引入barcode：使用带barcode的引物序列，进行带磁珠的PCR反应，靶向富集DNA分子；

步骤九、磁珠纯化PCR扩增产物。

进一步的，所述步骤一中FFPE样本DNA的提取是指：

单链接头的获得：

按照以下序列信息合成两条序列，

Adaptor序列：5’Pho-GCTACCCCAC-NNNNNNNNNNNN-AGATCGGAAG-XXXXXXXXXXXX-TEG-Biotin3’；

Splinter序列：3’NNNNNN-CGATGGGGTG5’；

Adaptor序列的纯化：总反应体系为20 ul：2 ul of 10 µM A序列, 16 ul 1 x T4 RNA 连接酶buffer, 1 ul Klenow fragment of E.coli DNA polymerase I,1 ul T4 多久核苷酸激酶；反应条件为37℃，20min,95℃，2min；

Splinter序列的纯化：总反应体系为20 ul：4 ul of 10 µM Splinter序列, 14 ul 1 x T4 RNA 连接酶buffer, 1 ul Klenow fragment of E.coli DNA polymerase I,1 ul T4 多聚核苷酸激酶；反应条件为37℃，20min,95℃，2min；

将上述20 ul的Adaptor序列与20 ul的Splinter序列组成40 ul反应体系，PCR仪上杂交，95℃，10s，逐步降低温度至10℃，降温速率为0.1℃/s，合成单链接头；

双链第二接头的获得：

按照以下序列信息合成两条序列：

5’CGACGCTCTTC-ddC 3’

5’Pho-GGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAG*T*G*T*A 3’