[发明专利]一种利用具有还原TCA途径的解脂耶氏酵母菌株好氧合成琥珀酸的方法

摘要

本发明公开了一种利用具有还原TCA途径的解脂耶氏酵母菌株好氧合成琥珀酸的方法，其中所述解脂耶氏酵母工程菌株外源表达了还原TCA途径中的关键酶：延胡索酸还原酶(FRD)和延胡索酸酶(FUM)，相对于传统氧化TCA途径而言理论产率大幅提高。并且分离纯化琥珀酸的步骤省却了电渗析或者酸化超滤过程，没有副产物硫酸铵的产生，具有可观的应用价值和前景。

主权项

一种利用具有还原TCA途径的解脂耶氏酵母菌株好氧合成琥珀酸的方法，步骤是：a)构建工程菌株解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)PGC91 TbFRD‑EcFUM；b)以改良YPD或者YPG培养基在好氧条件下培养构建的工程菌株生产琥珀酸；其特征在于：构建工程菌株解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)PGC91 TbFRD‑EcFUM的方法是：(1)以表达载体pKi‑1构建pKi1‑TbFRD质粒，以解脂耶氏酵母PGC91(Po1fΔsdh5 Δach1 Ylpyc)菌株为出发菌，构建过表达Tbfrd基因的解脂耶氏酵母PGC91 TbFRD(Po1fΔsdh5 Δach1 Ylpyc Tbfrd)；(2)以表达载体pKi‑1构建pKi1‑FUM质粒，以解脂耶氏酵母PGC91 TbFRD(Po1f Δsdh5 Δach1 Ylpyc Tbfrd)菌株为出发菌，构建得到过表达Ecfum基因的工程菌株，命名为解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)PGC91 TbFRD‑EcFUM(Po1fΔsdh5 Δach1 Ylpyc Tbfrd Ecfum)；该工程菌株引入了还原TCA途径，能表达延胡索酸还原酶TbFRD和延胡索酸酶EcFUM；其中所述延胡索酸还原酶来源于布氏锥虫(Trypanosoma brucei)，所述延胡索酸酶来源于大肠杆菌(Escherichia Coli)；以改良YPD或者YPG培养基在好氧条件下培养构建的工程菌株生产琥珀酸的方法是：好氧条件为30±1℃，摇瓶培养转速120‑220rpm，培养96±4h；改良YPD培养基的配方以重量百分比计为：2％蛋白胨，1％酵母粉，2％‑6％葡萄糖，余量为水；改良YPG培养基的配方以重量百分比计为：2％蛋白胨，1％酵母粉，2％‑6％甘油，余量为水；整个培养过程不外源添加酸碱剂维持发酵液中性pH值，后期发酵液pH为4.0‑5.0；培养过程中，每间隔12‑24h取样，在600nm波长下检测菌液的光吸收值，监测琥珀酸的含量。