[发明专利]一种利用具有还原TCA途径的解脂耶氏酵母菌株好氧合成琥珀酸的方法

说明书

本发明公开了一种利用具有还原TCA途径的解脂耶氏酵母菌株好氧合成琥珀酸的方法，其中所述解脂耶氏酵母工程菌株外源表达了还原TCA途径中的关键酶：延胡索酸还原酶(FRD)和延胡索酸酶(FUM)，相对于传统氧化TCA途径而言理论产率大幅提高。并且分离纯化琥珀酸的步骤省却了电渗析或者酸化超滤过程，没有副产物硫酸铵的产生，具有可观的应用价值和前景。

技术领域

本发明涉及一种利用具有还原TCA途径的解脂耶氏酵母菌株好氧合成琥珀酸的方法，属于代谢工程和微生物发酵领域。

背景技术

琥珀酸又称丁二酸，广泛地应用于清洁剂、表面活性剂、食品添加剂、抗菌剂以及制药行业，被美国能源部选为十二种最具商业价值的平台化合物之首(Werpy andPedersen,US Department of Energy.2005)。以可再生资源作为原料利用微生物发酵法生产的琥珀酸摆脱了对石油化工原料的依赖，是一种绿色平台产品。

琥珀酸的微生物合成主要依赖各种细菌，例如产琥珀酸放线杆菌和大肠杆菌等。这些微生物可以高效生产琥珀酸，就目前琥珀酸的产量、产率与生产力而言，细菌似乎更具有优势，但是细菌对酸和渗透压力耐受性低，发酵过程中需要不断调节pH，增加下游工业处理成本。而酵母可以进行低pH的生物发酵，除去菌体后的发酵液可以直接蒸发结晶，这使产物的下游处理成本大大降低。从长远来看，利用酵母作为平台菌株，将大大降低琥珀酸的生物合成成本并促进其商业化生产。酿酒酵母是研究、应用最为广泛的模式微生物之一，近年来许多研究人员尝试以酿酒酵母为宿主生产琥珀酸。Raab等人通过代谢工程改造策略敲除了酿酒酵母 SDH1、SDH2、IDH1和IDP1四个基因，最终实现了琥珀酸的氧化生产。摇瓶培养中，敲除菌株的琥珀酸产量和产率均很低分别为3.62g/L和0.11mol/mol葡萄糖(Raab etal.,2010)。由上所述，酿酒酵母合成琥珀酸的能力与大肠杆菌等细菌宿主差距较大，这严重阻碍了其工业应用前景。

解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)是一种重要的非常规酵母，具有安全性高、耐酸能力强、分泌多种代谢产物和能够利用多种碳水化合物等优点，它被视为潜在的生物技术工程菌株受到越来越多的关注。Yuzbashev等人首次报道了利用基因敲除技术构建了缺失琥珀酸脱氢酶活性的解脂酵母工程菌株，然后经过一系列化学诱变和定向筛选，得到的突变株在合成培养基中琥珀酸产量可达50.2g/L(Yuzbashev et al.,2016；Yuzbashevet al.,2010)。除此之外的一系列研究也证明了解脂耶氏酵母具有良好的琥珀酸生产潜能(Jost et al.,2015；Li et al., 2016；Yang et al.,2017)。在本课题组先前工作中，通过敲除解脂耶氏酵母野生型菌株Po1f (ATCC MYA-2613)中的sdh5基因得到一株琥珀酸脱氢酶缺陷型菌株PGC01003，该工程菌以甘油作为碳源经过400h发酵能够生产160g/L琥珀酸(Gao et al.,2016)。尽管PGC01003 菌株琥珀酸产量已经达到较高水平，仍然存在着发酵过程需要调节pH增加下游处理成本和发酵周期长等问题。随后，我们在PGC01003菌株基础上敲除Ylach以消除乙酸溢流，同时过表达酿酒酵母来源的丙酮酸羧激酶ScPCK和解脂耶氏酵母自身琥珀酰-CoA合酶YlSCS2，在低pH条件下最终筛选得到的工程菌株PGC202琥珀酸产量、产率和生产力分别达到110 g/L、0.5g/g甘油和0.8g/L/h(Cui et al.,2017)。