[发明专利]一种检测高致病性副溶血弧菌的LAMP-LFD的引物和探针及其应用

摘要

本发明涉及一种检测高致病性副溶血弧菌的LAMP‑LFD的引物和探针及其应用，其特征在于包括根据高致病性副溶血弧菌的pVPA3‑1质粒序列设计下述LAMP的两对引物核心和一条探针序列，适合于现场快速检测，有利于检测和控制养殖过程中高致病性副溶血弧菌的感染和爆发，具有操作简便、检测快速准确、结果判断明显的优点。

主权项

一种检测高致病性副溶血弧菌的LAMP‑LFD方法，其特征在于包括以下步骤：a.根据高致病性副溶血弧菌的pVPA3‑1质粒序列设计下述LAMP的两对引物核心和一条探针序列：F3外引物：5’‑CCAAATACACCAAATTAGTACAGAA‑3’B3外引物：5’‑AAATCATCATCGAGAATAAGCT‑3’FIP内引物：5’‑CTTGTTGGCTCACATGAACTCC‑ATACAATTACAGTAACATGAATCCG‑3’BIP内引物：5’‑AAGAAAAATACCCGGCCAGC‑AAGTGAGTGATATAGTGCGAC‑3’探针HP：5’‑GTCATACTGGCAGCA AGGAGT‑3’FIP内引物的5′端标有Biotin标记，在探针HP的5′端标标有FITC标记；b.LAMP反应体系配置如下：包含20mmol/L Tris‑HCl，pH为8.8，10mmol/L KCl，6.5mmol/L MgSO₄，10mmol/L(NH₄)₂SO₄，0.1％Tween‑20，0.8mol/L Betaine，1.4mmol/L dNTPs，1.6μmol/L内引物，0.2μmol/L外引物，8U Bst DNA聚合酶，1μl DNA模板，无菌双蒸水补至25μl；c.LAMP扩增反应：将上述反应体系进行扩增，反应温度为60‑65℃，反应时间为20‑60min；d.LFD检测：扩增后在反应体系中加入20pmol的探针HP，65℃杂交5min，反应结束后，取8μl扩增产物，滴加到样品垫上，将LFD试纸条的样品垫向下竖立于含有100μl缓冲液的酶标板中，15‑30min后记录判读区的检测结果。