[发明专利]一种检测高致病性副溶血弧菌的LAMP-LFD的引物和探针及其应用

说明书

本发明涉及一种检测高致病性副溶血弧菌的LAMP‑LFD的引物和探针及其应用，其特征在于包括根据高致病性副溶血弧菌的pVPA3‑1质粒序列设计下述LAMP的两对引物核心和一条探针序列，适合于现场快速检测，有利于检测和控制养殖过程中高致病性副溶血弧菌的感染和爆发，具有操作简便、检测快速准确、结果判断明显的优点。

技术领域

本发明属于水产养殖微生物检测技术领域，具体涉及一种检测高致病性副溶血弧菌的LAMP-LFD的引物和探针及其应用。

背景技术

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus, 简称VP) 最早是由Fujino 等于1953年从日本一个食物中毒患者中初次分离得到的, 是一种革兰氏阴性嗜盐菌, 常呈多态性,有鞭毛, 无荚膜和芽孢。副溶血弧菌分布于世界各地，通常广泛分布于近海区域、盐湖及鱼、贝类等海产品中, 是海水养殖中有极大危害的病原弧菌之一，可感染大黄鱼（Pseudosciaena crocea）、牙鲆（Paralichthys olivaceus）、真鲷（pagrosomus major）、石斑鱼（Epinephelussp.）、南美白对虾(Litopenaeus vannamei)、文蛤（Meretrix mertrix）等大多数海水养殖动物。南美白对虾感染高致病性副溶血弧菌后体色呈白浊微红，多数肝胰腺肿大，质地松软，颜色呈淡白或淡黄色；发病期间，通常在趴伏于池塘边坡上，失去食欲，空肠空胃，该病发展十分迅速，死亡率和排塘率极高，从发病到排塘，最短仅2-3天，严重威胁对虾养殖业,2013年全球养殖对虾产量预计较2012年减少23%，其中泰国下降约50%，我国下降约17%。为有效控制副溶血弧菌病原的发生扩散, 准确即时的检测手段是预防控制该菌传播的关键所在。

目前对副溶血弧菌常用的检测方法有生化鉴定、免疫学方法、分子生物学方法等。但是这些方法在快速检测、定性和精确定量方面难以兼顾，并且传统方法费时费力，对于需要检测大量样本的出入境检疫、食品、卫生以及兽医部门的实验室是一种沉重的负担。且PCR检测方法需要昂贵的仪器设备、较高检测费用以及对检测人员较高的技术要求而使其不适用于现场快速检测及基层普及应用。2000年，日本科学家Notomi等发明了一种全新的核酸扩增方法——环介导等温扩增技术(LAMP, loop-mediated isothermalamplification）。该法在等温条件下（60-65℃）就能完成扩增反应，它可以在1 h内于恒温条件下特异地扩增DNA到10⁹个拷贝，在保持PCR技术优点的基础上，进一步缩短了检测时间，现已在其他研究领域广泛地应用于病原菌的快速检测。然而，LAMP技术存在也存在着易发生交叉污染出现假阳性，特异性较差的缺点。横向流动试纸条技术(LFD, lateral flowdipstick)是一种新的试纸检测技术。此检测技术可以与LAMP技术通过单克隆抗体技术等免疫学方法有机结合,反应中异硫氰酸荧光素（Fluorescein isothiocyanate, FITC）标记的探针与生物素标记的LAMP扩增产物特异性杂交，并与胶体金标记的抗异硫氰酸荧光素的抗体结合形成三元复合物，结合在横向流动试纸条技术具有生物素抗体的检测线上；未杂交的异硫氰酸荧光素标记探针与胶体金标记的抗异硫氰酸荧光素的抗体形成不含生物素的两元复合物，通过检测线，结合在控制线上。因此可以通过观察试纸条上显示，判断LAMP是否有扩增产物。该检测方法避免了琼脂糖凝胶电泳或荧光染料染色肉眼观察由非特异性扩增造成的假阳性，并进一步提高了反应的特异性和灵敏度，且操作简便安全。

目前，该技术在对虾白斑病毒（WSSV, White spot syndrome virus）、鳗利斯顿氏菌（Listonella anguillarum）、传染性脾肾坏死病毒（ISKNV，Infectious spleen andkidney necrosis virus）等养殖动物病毒性病原的检测上得到初步应用。

发明内容