[发明专利]一种区分四种血清型禽腺病毒I群的纳米多重PCR方法

摘要

本发明涉及一种区分四种血清型禽腺病毒I群的纳米多重PCR方法，根据GenBank公布的4、8a、8b和11型禽腺病毒I群六邻体基因序列，设计合成各型特异性引物；提取基因后进行纳米多重PCR扩增，PCR反应条件为95℃预变性5min，94℃30s，53℃退火1min，72℃1min49s，30个循环；72℃延伸10min；纳米多重PCR扩增反应结束后，取PCR产物，以DL2000为Maker，1％琼脂糖凝胶电泳，观察扩增片段大小，确定病毒的血清型。本发明方法明显缩短检测时间；加入纳米颗粒，在同时检测到四种血清型病毒的情况下，敏感性较普通多重PCR至少提高10倍；特异性强、敏感性高、稳定性好，能快速、敏感、准确地对我国主要流行血清型的禽腺病毒I群进行分型。

主权项

一种区分四种血清型禽腺病毒I群的纳米多重PCR方法，其特征在于按照以下步骤操作：第一步，纳米多重PCR引物设计：根据GenBank公布的4、8a、8b和11型禽腺病毒I群六邻体基因序列，设计合成各型特异性引物；4型禽腺病毒I群引物F:5’‑CAARTTCAGRCAGACGGT‑3’R:5’‑AAGAGGCCCGGGCAATGC‑3’；8a型禽腺病毒I群引物F:5’‑CAARTTCAGRCAGACGGT‑3’R:5’‑AATGTTTGACGAGCTGATGGG‑3’；8b型禽腺病毒I群引物F:5’‑CAARTTCAGRCAGACGGT‑3’R:5’‑ATGCTGCAGCTGTTGCCGTAG‑3’；11型禽腺病毒I群引物F:5’‑CAARTTCAGRCAGACGGT‑3’R:5’‑ACTGCCGTCGTCTCGTCTAAG‑3’；第二步，基因的提取：取4、8a、8b和11型禽腺病毒I群标准毒株细胞研磨液400μL于1.5mLEP管中，加入400μL氯仿、600μL裂解液，混匀后4℃沉淀10min，之后12000r/min离心，取上清600μL，加入异丙醇800μL,4℃沉淀30min后12000r/min离心，弃上清后干燥，用20μL去离子水溶解；所述裂解液的组成为：硫氰酸胍9.456g，硫氰酸胺3.044g，醋酸钠13.60g，甘油5ml，苯酚38ml，水57ml；第三步，纳米多重PCR扩增:1、PCR反应体系：2×Nano‑QPCRmix6μL，Taq enzyme 0.2μL，上、下游混合引物各1μL，模板0.5μL，去离子水3.3μL；所述上、下游混合引物同第一步；2、PCR反应条件：95℃预变性5min，94℃30s，53℃退火1min，72℃1min49s，30个循环；72℃延伸10min；第四步，琼脂糖凝胶电泳：纳米多重PCR扩增反应结束后，取PCR产物8μL，以DL2000为Maker，质量百分比为1％的琼脂糖凝胶电泳，观察扩增片段大小，确定病毒的血清型；扩增片段为2193bp为4型禽腺病毒I群，扩增片段为1045bp为8a型禽腺病毒I群，扩增片段为371bp为8b型禽腺病毒I群，扩增片段为674bp为11型禽腺病毒I群。