[发明专利]一种区分四种血清型禽腺病毒I群的纳米多重PCR方法

权利要求书

1.一种非诊断目的的区分四种血清型禽腺病毒I群的纳米多重PCR方法，其特征在于：按照以下步骤操作：

第一步，纳米多重PCR引物设计：根据 GenBank 公布的4、8a、8b和11型禽腺病毒I群六邻体基因序列，设计合成各型特异性引物；4型禽腺病毒I群引物F：5’-CAARTTCAGRCAGACGGT-3’，4型禽腺病毒I群引物R：5’-AAGAGGCCCGGGCAATGC-3’；8a型禽腺病毒I群引物F：5’- CAARTTCAGRCAGACGGT -3’，8a型禽腺病毒I群引物R：5’-AATGTTTGACGAGCTGATGGG -3’；8b型禽腺病毒I群引物F：5’- CAARTTCAGRCAGACGGT -3’，8b型禽腺病毒I群引物R：5’- ATGCTGCAGCTGTTGCCGTAG -3’；11型禽腺病毒I群引物F：5’-CAARTTCAGRCAGACGGT-3’，11型禽腺病毒I群引物R：5’- ACTGCCGTCGTCTCGTCTAAG -3’；

第二步，基因的提取：取4、8a、8b和11型禽腺病毒I群标准毒株细胞研磨液400μL于1.5mL EP管中，加入400μL氯仿、600μL裂解液，混匀后4℃沉淀10min，之后12000r/min离心，取上清600μL，加入异丙醇800μL，4℃沉淀30min后12000r/min离心，弃上清后干燥，用20μL去离子水溶解；所述裂解液的组成为：硫氰酸胍9.456g，硫氰酸胺3.044g，醋酸钠13.60g，甘油5ml，苯酚38ml，水57ml；

第三步，纳米多重PCR扩增：PCR反应体系：2×Nano-QPCRmix6μL，Taq酶 0.2μL，第一步中设计的4种引物F的混合物1μL，第一步中设计的4种引物R的混合物1μL，模板0.5μL，去离子水3.3μL；PCR反应条件：95℃预变性5min，94℃30s，53℃退火1min，72℃ 109 s，30个循环；72℃延伸10min；

第四步，琼脂糖凝胶电泳：纳米多重PCR扩增反应结束后，取PCR产物8μL，以DL2000为Maker，质量百分比为1%的琼脂糖凝胶电泳，观察扩增片段大小，确定病毒的血清型；扩增片段为2193bp为4型禽腺病毒I群，扩增片段为1045bp为8a型禽腺病毒I群，扩增片段为371bp为8b型禽腺病毒I群，扩增片段为453bp为11型禽腺病毒I群。