[发明专利]一种区分四种血清型禽腺病毒I群的纳米多重PCR方法

说明书

本发明涉及一种区分四种血清型禽腺病毒I群的纳米多重PCR方法，根据GenBank公布的4、8a、8b和11型禽腺病毒I群六邻体基因序列，设计合成各型特异性引物；提取基因后进行纳米多重PCR扩增，PCR反应条件为95℃预变性5min，94℃30s，53℃退火1min，72℃1min49s，30个循环；72℃延伸10min；纳米多重PCR扩增反应结束后，取PCR产物，以DL2000为Maker，1％琼脂糖凝胶电泳，观察扩增片段大小，确定病毒的血清型。本发明方法明显缩短检测时间；加入纳米颗粒，在同时检测到四种血清型病毒的情况下，敏感性较普通多重PCR至少提高10倍；特异性强、敏感性高、稳定性好，能快速、敏感、准确地对我国主要流行血清型的禽腺病毒I群进行分型。

技术领域

本发明涉及一种纳米多重PCR方法，特别是涉及一种区分四种血清型禽腺病毒I群的纳米多重PCR方法，属于动物病毒检测技术领域。

背景技术

禽腺病毒（Fowl adenovirus ，FAdV）I群主要包括12个血清型，Changjing Li 等（2016）对我国2006年-2016年来临床禽腺病毒I群的分离毒株Hexon基因进行了测序分析，表明我国主要流行的血清型有4、8a、8b和11型，禽腺病毒I群对肉鸡的高感染率和高死亡率给养鸡业造成了严重的经济损失。这四种血清型禽腺病毒均引起肉鸡出现严重的肝脏炎症反应，引起的临床症状极为相似，这为临床不同血清型禽腺病毒I群感染的检测带来困难。此外，不同血清型禽腺病毒Ⅰ群之间不能形成交叉保护，故建立临床禽腺病毒Ⅰ群感染的检测方法并对感染病毒进行分型，对禽腺病毒Ⅰ群感染的预防与控制具有十分重要的意义。

血清学检测方法是禽腺病毒I群分型的常规方法，但缺乏标准抗血清，使得本方法应用受限。目前主要通过分子生物学方法进行分型，主要包括：PCR结合测序，通过比较分析基因序列对毒株进行基因分型；根据病毒基因组限制性酶切图谱分析分为不同的基因型；高分辨熔解曲线的基因进行分型。这三种方法中，其中第一种为目前最常用的分型方法，但这三种方法都需要通过PCR对基因进行扩增后，进行测序、酶切和荧光等相关分析，故由于费时、需要特殊仪器及价格昂贵等原因，不适合于临床大量样品中禽腺病毒I群的分型鉴定。

建立简便、快速的临床禽腺病毒I群感染的分型检测方法，关键在于缩短检测时间、去除繁琐的后续分析、且能一次性准确确定感染病毒的血清型。目前，有关禽腺病毒I群的通用检测方法已有报道，但现有方法中中尚未见有对我国主要流行的4、8a、8b和11型禽腺病毒I群的快速简便的分型检测方法的公开。

多重PCR分型方法可通过一次PCR扩增即可确定血清型，是一种快速、准确的分型方法。为提高普通多重PCR检测的敏感性，加入纳米颗粒，建立纳米多重PCR分型方法，可用于临床禽腺病毒I群的分型确定。

发明内容

本发明的目的在于克服现有禽腺病毒I群分型方法中的繁琐、需特殊仪器、敏感性差等方面存在的缺陷，寻求提供一种快速、简便、准确的区分四种血清型禽腺病毒I群的纳米多重PCR方法。鉴于目前我国禽腺病毒I群主要流行的为4、8a、8b和11型，建立针对这四种血清型的多重PCR区分方法可以快速简便进行分型，为进一步提高分型方法的敏感性，将多重PCR分型方法中加入纳米颗粒，建立纳米多重PCR的分型方法，以提高检测的敏感性。

为了实现上述目的，本发明的一种区分四种血清型禽腺病毒I群的纳米多重PCR方法按照以下步骤操作：

一、纳米多重PCR引物设计：