[发明专利]一种快速检测纺织品中β‑溶血性链球菌的方法

摘要

本发明公开了一种快速检测纺织品中β‑溶血性链球菌的方法，结合IMS和RPA两种技术，采用免疫磁珠捕获技术富集样品中β‑溶血性链球菌，针对β‑型溶血性链球菌的特异性HtrA的靶基因，设计一套以RPA技术为核心技术的特异性引物及探针，运用RPA技术检测被富集的β‑型溶血性链球菌。本方法整个过程不需要培养，节约时间、快速、高效，特异性好，灵敏度高，抗干扰性强，适用范围广，检测成本低，不仅适用于卫生防疫及卫生监督部门，还适用于企业及家庭卫生的检测。

主权项

一种快速检测纺织品中β‑溶血性链球菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、免疫磁珠的制备取0.1mL磁珠液于盛有1.0mL PBST缓冲液的离心管中，混匀，3000r/min离心2min，弃液体；重复上述步骤清洗3次，加入1.0mL PBST缓冲液使磁珠重悬其中；向上述重悬液中加入0.1mLβ‑溶血性链球菌免疫血清，放摇床，室温轻缓旋转振荡3h；用1.0mL 1×洗液清洗5次后，加入0.5mL重悬液，于4℃保存备用；步骤二、RPA引物及探针设计于NCBI数据库中下载编码HtrA的靶基因序列，采用CLUSTAL X软件进行序列比对，在HtrA基因中找到了一段仅保守于β‑溶血性链球菌的A、B、C、G组的特异性序列，并在此序列中设计一套以RPA技术为核心技术的特异性引物及探针；步骤三、β‑型溶血性链球菌的免疫磁珠富集制备检样悬液，免疫磁珠富集，得带有β‑溶血性链球菌的磁珠悬液；步骤四、RPA鉴定4.1)DNA模板的制备取100μLβ‑溶血性链球菌磁珠悬液于0.5mL离心管中，100℃水浴10min，5000r/min离心5min，取上清液，‑20℃保存备用；4.2)RPA扩增反应4.2.1)根据样本数量设定所需要的RPA反应管数n(n＝1管空白对照+1管阴性对照+1管阳性对照+样本数)；向含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp Exo RPA反应管中依次加入表1中各成分，充分混匀后2000r/min离心10sec，将反应试管放在RPA便携式荧光检测仪(Twista)中进行实时荧光扩增，37℃恒温反应20min；表1 反应体系RPA试剂1管试验用量n管试验用量水化缓冲液29.5μL29.5×nμLRPA‑F2.0μL2.0×nμLRPA‑R2.0μL2.0×nμLRPA‑P0.5μL0.5×nμL去离子水14.0μL14.0×nμLDNA模板2.0μL2.0×nμL总体积50.0μL50.0×nμL4.2.2)设定空白对照、阴性对照、阳性对照每次反应均设置阴性对照、空白对照和阳性对照；空白对照：以水代替DNA模板；阴性对照：以水代替样品，提取DNA作为RPA反应的模板；阳性对照：β‑溶血性链球菌标准菌株提取DNA作为RPA反应的模板；4.3)结果观察反应结束后，观察RPA便携式荧光检测仪(Twista)生成的扩增曲线，空白对照、阴性对照无扩增曲线，阳性对照有典型S型扩增曲线，判定实验有效，否则实验视为无效；步骤五、结果报告在空白对照、阴性对照无扩增曲线，阳性对照有典型S型扩增曲线的前提下，检样无扩增曲线报告样品中未检出β‑溶血性链球菌；检样出现类似阳性对照的S型扩增曲线报告样品中检出β‑溶血性链球菌。