[发明专利]一种快速检测纺织品中β‑溶血性链球菌的方法

权利要求书

1.一种快速检测纺织品中β-溶血性链球菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、免疫磁珠的制备

取0.1mL磁珠液于盛有1.0mL PBST缓冲液的离心管中，混匀，3000r/min离心2min，弃液体；重复上述步骤清洗3次，加入1.0mL PBST缓冲液使磁珠重悬其中；向上述重悬液中加入0.1mLβ-溶血性链球菌免疫血清，放摇床，室温轻缓旋转振荡3h；用1.0mL 1×洗液清洗5次后，加入0.5mL重悬液，于4℃保存备用；

步骤二、RPA引物及探针设计

于NCBI数据库中下载编码HtrA的靶基因序列，采用CLUSTAL X软件进行序列比对，在HtrA基因中找到了一段仅保守于β-溶血性链球菌的A、B、C、G组的特异性序列，并在此序列中设计一套以RPA技术为核心技术的特异性引物及探针；

步骤三、β-型溶血性链球菌的免疫磁珠富集

制备检样悬液，免疫磁珠富集，得带有β-溶血性链球菌的磁珠悬液；

步骤四、RPA鉴定

4.1)DNA模板的制备

取100μLβ-溶血性链球菌磁珠悬液于0.5mL离心管中，100℃水浴10min，5000r/min离心5min，取上清液，-20℃保存备用；

4.2)RPA扩增反应

4.2.1)根据样本数量设定所需要的RPA反应管数n(n＝1管空白对照+1管阴性对照+1管阳性对照+样本数)；向含有冻干酶粉的0.2mL TwistAmp Exo RPA反应管中依次加入表1中各成分，充分混匀后2000r/min离心10sec，将反应试管放在RPA便携式荧光检测仪(Twista)中进行实时荧光扩增，37℃恒温反应20min；

表1 反应体系

RPA试剂1管试验用量n管试验用量水化缓冲液29.5μL29.5×nμLRPA-F2.0μL2.0×nμLRPA-R2.0μL2.0×nμLRPA-P0.5μL0.5×nμL去离子水14.0μL14.0×nμLDNA模板2.0μL2.0×nμL总体积50.0μL50.0×nμL

4.2.2)设定空白对照、阴性对照、阳性对照

每次反应均设置阴性对照、空白对照和阳性对照；

空白对照：以水代替DNA模板；

阴性对照：以水代替样品，提取DNA作为RPA反应的模板；

阳性对照：β-溶血性链球菌标准菌株提取DNA作为RPA反应的模板；

4.3)结果观察

反应结束后，观察RPA便携式荧光检测仪(Twista)生成的扩增曲线，空白对照、阴性对照无扩增曲线，阳性对照有典型S型扩增曲线，判定实验有效，否则实验视为无效；

步骤五、结果报告

在空白对照、阴性对照无扩增曲线，阳性对照有典型S型扩增曲线的前提下，检样无扩增曲线报告样品中未检出β-溶血性链球菌；检样出现类似阳性对照的S型扩增曲线报告样品中检出β-溶血性链球菌。

2.根据权利要求1所述的一种快速检测纺织品中β-溶血性链球菌的方法，其特征在于，步骤三中制备检样悬液，免疫磁珠富集具体为无菌操作称取25g检样至装有100mL蛋白胨水的带滤网无菌均质袋内，轻缓振荡30min；过滤检样，上清液转移于离心管，5000r/min离心20min，弃上清液体，沉淀重悬于1.0mL PBST缓冲液中；取全部检样悬液于装有0.1mL免疫磁珠悬液的小管中，室温轻缓旋转振荡30min；小心移出管中液体，加入1.0mL洗液混匀，3min后移出洗液，重复清洗5次，加入0.1mL重悬液使吸附β-溶血性链球菌的磁珠重悬其中；所得带有β-溶血性链球菌的磁珠悬液可直接用于提取细菌DNA。