[发明专利]一种快速检测纺织品中β‑溶血性链球菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种β-溶血性链球菌的检测方法，具体涉及一种快速检测纺织品中β-溶血性链球菌的方法。

背景技术

β-溶血性链球菌(β-hemolytic streptococcus)在自然界中分布较广，存在于水、空气、尘埃、粪便及健康人和动物的口腔、鼻腔、咽喉中。在链球菌属中与环境卫生和人身安全有关的链球菌主要是β-溶血性链球菌，按其C抗原，可分为18个组，对人致病的大多属于A组、B组、C组和G组。β-溶血性链球菌对人的毒力、侵袭力较强，能产生多种胞外酶和外毒素，引起各种化脓性疾病、肺炎、伤口感染和败血症等。可通过直接接触、空气飞沫或皮肤、粘膜伤口感染传播，通常引起皮肤和皮下组织的化脓性炎症及呼吸道感染，还可引起猩红热、流行性咽炎、急性扁桃体炎和脓疱疮，甚至可引起严重的侵袭性感染如败血症、坏死性筋膜炎和链球菌中毒休克综合征。

β-溶血性链球菌属革兰氏阳性球菌，无芽胞无鞭毛，血平板培养后形成灰白色、半透明、表面光滑、边缘整齐、直径呈0.5mm～0.75mm的细小菌落，周围形成一个2mm～4mm宽、界限分明、完全透明的无色溶血环，也称乙型溶血。

该菌抵抗力一般不强，60℃30min即被杀死，对常用消毒剂敏感，但抗干燥能力强，在干燥尘埃中能生存数月。由于纺织品存在的特殊性(暴露在空气中)，很容易被附着污染，通过接触传染给人类。

该菌实验室培养营养要求较高，需氧或兼性厌氧菌，普通培养基上生长不良，需补充血清、血液、腹水，大多数菌株需核黄素、维生素B6、烟酸等生长因子，因此不利于传统培养。最适生长温度为37℃，在20℃～42℃能生长，最适pH为7.4-7.6。在血清肉汤中易成长链，管底呈絮状或颗粒状沉淀生长。分解葡萄糖，产酸不产气，对乳糖、甘露醇、水杨苷、山梨醇、棉子糖、蕈糖、七叶苷的分解能力因不同菌株而异。一般不分解菊糖，不被胆汁溶解，触酶阴性。

目前，针对β-溶血性链球菌检测方法主要有FDA推荐的分离培养、生化及血清学鉴定、免疫学方法和PCR。传统检测方法程序繁琐、周期长，通常需要6d以上，β-溶血性链球菌在常规检测中属难培养微生物，灵敏度较低传统方法常出现假阴性；免疫学方法制备抗体较困难，易出现交叉污染，特异性和灵敏度均较低；PCR法敏感、准确、快速，可替代传统检测方法，但需要昂贵的仪器设备，对检测人员较高的技术要求，难以在基层单位推广和普及。

免疫磁珠富集技术(immunomagnetic separation，IMS)：用目标菌抗体包被在磁珠表面，然后在磁场的作用下吸附检样液中的目标微生物，使其与影响和干扰检测灵敏度的检样残渣和其他杂菌分离开，起到浓缩、纯化目标微生物的作用，从而提高灵敏度和检出率。IMS方法操作简便，只需在检样液中加入免疫磁珠，室温振荡混匀一定的时间后，在磁场作用下反复用缓冲液洗涤即可，捕获目标菌的免疫磁珠不用与目标菌分离，直接进行后续实验。具有分离速度快，效率高，可重复性好，操作简单，不需要昂贵的仪器设备，不影响被分离细胞或其它生物材料的生物学性状和功能等优点，在微生物检测方面具有很大的优势。

重组酶聚合酶等温扩增技术(recombinase ploymerase amplification，RPA)：是一种新型的恒温扩增技术，该技术以T4噬菌体核酸复制机制为原理，利用重组酶和单链结合蛋白在常温下协同实现引物和模板的特异结合。扩增产物可以通过琼脂糖电泳、克隆测序或实时荧光等方法检测。其中添加寡核苷酸探针实时监测可提高方法的特异性，适用于病原微生物的快速检测。

与其它DNA检测方法相比，实时荧光RPA法具有以下优势：①在恒温条件下进行核酸的扩增，摆脱了PCR反应过程精准热循环的局限。②不需要较高或精确的温度，并且可在25℃～42℃之间进行反应。③反应速度较快，一般从开始到完成只需15min～30min，远快于其他等温扩增技术或PCR技术。④高灵敏性和特异性，其灵敏性和特异性与实时荧光PCR无差异。⑤操作简单，可以使用多种仪器(便携式小型实时荧光检测仪器、实时荧光定量PCR仪器)进行检测，其中使用便携式小型实时荧光检测仪器，价格低廉，有利于在基层单位现场实施检测和推广应用。