[发明专利]一种高效高通量启动子与增强子文库构建方法

摘要

本发明公开了一种高通量启动子捕获系统，其是将基因组随机片段插入到BamHI/HindIII双酶切的Pro‑free‑trap载体中，从而得到了各类瞬时转染启动子筛选系统Pro‑DNA‑Trap。通过酶标仪对潜在的启动子片段(随机基因组DNA)、已知启动子CMV和空载体进行碱性磷酸酶报告基因活性检测，若重组质粒表达一种碱性磷酸酶，则能与底物对硝基苯磷酸二钠发生显色反应，通过检测后可知该潜在启动子序列是否具有启动子活性。

主权项

1.针对上述问题，本发明提供一种适用于各种转染、转化细胞的高效的启动子及增强子捕获技术，可被用于新基因和超强启动子的发现，本发明是这样获得的：一种适用于各种转染、转化细胞的高效的启动子及增强子捕获技术，其具体步骤如下：A)用含10％血清的细胞培养基于37℃，5％CO2培养乳腺癌4T1细胞；当细胞生长至对数生长期时提取基因组DNA和总RNA其中，所述含10％血清的细胞培养基配制方法为：以质量百分百计，将89％的RPMI‑1640培养液、10％的胎牛血清及1％的青霉素‑链霉素溶液混合后获得；B)使用限制性内切酶BamH I和Hind III随机酶切转移性的小鼠乳腺癌4T1细胞基因组DNA和表达载体Pro‑free‑trap；于37℃反应4h，即获得小鼠乳腺癌4T1细胞基因组基因组DNA片段和表达载体Pro‑DNA‑trap的酶切产物线性化载体DNA；酶切体系：10×BufferBamH I 2μL，4μL小鼠乳腺癌4T1细胞基因组DNA，0.8μL 10U/μL的限制性内切酶BamH I，1.6μL 10 U/μL的限制性内切酶HindIII，ddH2O补足至总体积20μL；C)配制线性化载体DNA和所有随机酶切后的基因组DNA片段的连接反应体系，于22℃反应1h，获得重组质粒；连接反应体系：10×T4 DNA Ligase Buffer 1μL，步骤B)获得的基因组DNA片段5μL，步骤B)获得的线性化载体3μL，T4 DNA Ligase 1μL；D)将连接产物转化大肠杆菌感受态GT115细胞，于低盐固体LB培养基中37℃培养12h，获得单克隆；E)挑取全部单克隆，用含有博来霉素的低盐液体LB于37℃，180rpm摇床中避光培养12h；F)提取菌液中的质粒并用限制性内切酶BamH I和Hind III进行双酶切验证正确后将质粒贮存于‑20℃；G)以pEGFP‑N1质粒为模板，以SEAP‑P‑F和SEAP‑P‑R为上下游引物，进行PCR扩增CMV启动子并测序鉴定；PCR反应体系：2.5μL 10×Taq Easy Buffer，2μL 2.5mM的dNTPs，0.5μL 5U/μL的Taq polymerase，1μL 10μM的上游引物，1μL 10μM的下游引物，10ng/μL的模板1μL，ddH2O补足至总体系为25μL；PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，40个循环；72℃延伸10min；H)用限制性内切酶BamH I和HindIII酶切步骤G)获得的CMV启动子目的片段，于37℃反应4h，即获得可用于连接反应的目的片段；酶切体系：2μL 10×Buffer BamH I，5μL步骤G)获得的DNA片段，0.8μL 10U/μL的限制性内切酶BamH I，1.6μL 10U/μL的限制性内切酶HindIII，ddH2O补足至总体积20μL；I)配制步骤B)获得的线性化的Pro‑free‑trapc载体和步骤H)获得的目的片段的连接反应体系，于22℃反应1h，获得重组质粒Pro‑CMV‑trap；连接反应体系：14μL步骤H)获得的酶切片段，3μL步骤B)获得的线性化的Pro‑free‑trap载体，2μL 10×T4 DNA Ligase Buffer，1μL T4 DNA Ligase；J)连接产物转化大肠杆菌GT115感受态细胞，并涂布于低盐LB固体培养基上37℃培养12h，获得单克隆；K)挑取单克隆，用含有博来霉素的低盐液体LB于37℃，180rpm摇床中避光培养12h；将阳性克隆菌液进行测序鉴定并提取质粒；L)将脂质体用细胞培养液稀释25倍，室温放置5min，将步骤K)获得的质粒分别加入稀释好的脂质体中，均匀混合，室温放置20min；M)将对数生长期的小鼠乳腺癌4T1细胞接种于24孔细胞培养板中，每孔中均匀分散5×105个细胞并加入500μL无抗生素含10％血清的细胞培养基，37℃，5％CO2培养24h；转染前弃去各孔中的细胞培养基，向各孔中加入步骤L)获得的质粒与脂质体的混合物，混匀后于摇床缓慢摇匀10min，于37℃，5％CO2培养5小时后吸出细胞培养液，换成500μL无抗生素含10％血清的新鲜培养液，于37℃，5％CO2培养；转染36h后，检测碱性磷酸酶活性；并设置mSEAP阳性对照质粒及阴性对照脂质体Lipofecton 2000。