[发明专利]一种高效高通量启动子与增强子文库构建方法

说明书

本发明公开了一种高通量启动子捕获系统，其是将基因组随机片段插入到BamHI/HindIII双酶切的Pro‑free‑trap载体中，从而得到了各类瞬时转染启动子筛选系统Pro‑DNA‑Trap。通过酶标仪对潜在的启动子片段(随机基因组DNA)、已知启动子CMV和空载体进行碱性磷酸酶报告基因活性检测，若重组质粒表达一种碱性磷酸酶，则能与底物对硝基苯磷酸二钠发生显色反应，通过检测后可知该潜在启动子序列是否具有启动子活性。

技术领域

本发明涉及细胞生物技术、基因工程和遗传工程领域，是一种适用于各种转染、转化细胞的高通量捕获启动子及增强子的方法。主要涉及将质粒(Pro-trap)上连入基因组随机酶切片段，从而构建出带有随机片段的启动子筛选重组质粒Pro-promoter。通过检测碱性磷酸酶报告基因的表达强度从而得知随机酶切片段是否具有启动子活性及活性强度。

背景技术

真核生物基因表达受到多种因子的调控，例如转录因子、miRNA、IncRNA等。目前基因表达调控分为转录水平调控、翻译水平调控、翻译后加工水平调控。其中转录水平调控在基因表达调控中尤为重要。而启动子在这一过程中有着很关键的作用(Keasling etal.2008)。启动子通常是指位于调控基因的上游能与RNA聚合酶结合的一段DNA 序列(Carninci and Sandelin2006)。目前，RNA聚合酶主要有三种，分别是RNA聚合酶I、RNA聚合酶II和RNA聚合酶III。因此启动子也有与其对应的三种rRNA基因启动子(I型)、RNA(II型)和tNA基因启动子(III型)(Putthoff and Akyuz 2003)。I 型和III型启动子属于原核生物，主要在基因转录起始位点的上游(Dieci and Fiorino 2007)，而真核生物启动子属于II型启动子，启动子大部分都位于其所调控基因的上游。然而，目前高通量捕获启动子和增强子仍是一个困难。目前在细菌中进行高通量捕获启动子的方法是采用乳化反应和连接酶用于快速筛选和检测细菌中启动子的活性(Takaaki Kojimaet.al.)。在植物中主要是通过T-DNA介导的promoter进行启动子筛选(Pratibhaet.al. 2013)。在动物细胞中主要是通过LTR介导的插入进行启动子的筛选(Von M H，Reddy S， Ruley H E 1990)。利用外源性逆转录病毒DNA插入小鼠细胞系被首先报道(Jaenisch 1976)，逆转录病毒DNA插入基因组基因捕获技术进行基因检测已逐渐形成(Pinson KI et.al.2000)。基本上，基因陷阱技术是基于质粒或逆转录病毒的基于载体的基因寻找工具，其包含选择性标记或报告基因。当载体整合到宿主中具有相同ORF的功能基因的位置时，选择标记或报告基因只能表达(Brown SDand Nolan PM 2000)。根据载体中元件的差异，基因陷阱技术进一步发展为增强子捕获，启动子捕获和基因捕获。启动子捕获载体含有报告基因和无启动子报告基因[33]。当无启动子报告载体随机插入基因组时，如果插入的报告基因ORF和未鉴定的宿主基因ORF形成融合ORF，则翻译的融合蛋白来自宿主基因，报道基因报告存在活性宿主启动子附近。因此，可以鉴定并测序具有启动子活性的片段，以测定启动子序列组成(Stanford WL，Cohn JB，CordesSP 2001)。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种适用于各种转染、转化细胞的高效的启动子及增强子捕获技术，可被用于新基因和超强启动子的发现，本发明是这样获得的：

一种适用于各种转染、转化细胞的高效的启动子及增强子捕获技术，其具体步骤如下：

A)用含10％血清的细胞培养基于37℃，5％CO₂培养乳腺癌4T1细胞；当细胞生长至对数生长期时提取基因组DNA和总RNA；

其中，所述含10％血清的细胞培养基配制方法为：以质量百分百计，将89％的RPMI-1640 培养液、10％的胎牛血清及1％的青霉素-链霉素溶液混合后获得；