[发明专利]一种高效高通量启动子与增强子文库构建方法

权利要求书

1.针对上述问题，本发明提供一种适用于各种转染、转化细胞的高效的启动子及增强子捕获技术，可被用于新基因和超强启动子的发现，本发明是这样获得的：

一种适用于各种转染、转化细胞的高效的启动子及增强子捕获技术，其具体步骤如下：

A)用含10％血清的细胞培养基于37℃，5％CO₂培养乳腺癌4T1细胞；当细胞生长至对数生长期时提取基因组DNA和总RNA

其中，所述含10％血清的细胞培养基配制方法为：以质量百分百计，将89％的RPMI-1640培养液、10％的胎牛血清及1％的青霉素-链霉素溶液混合后获得；

B)使用限制性内切酶BamH I和Hind III随机酶切转移性的小鼠乳腺癌4T1细胞基因组DNA和表达载体Pro-free-trap；于37℃反应4h，即获得小鼠乳腺癌4T1细胞基因组基因组DNA片段和表达载体Pro-DNA-trap的酶切产物线性化载体DNA；

酶切体系：10×BufferBamH I 2μL，4μL小鼠乳腺癌4T1细胞基因组DNA，0.8μL 10U/μL的限制性内切酶BamH I，1.6μL 10 U/μL的限制性内切酶HindIII，ddH₂O补足至总体积20μL；

C)配制线性化载体DNA和所有随机酶切后的基因组DNA片段的连接反应体系，于22℃反应1h，获得重组质粒；

连接反应体系：10×T4 DNA Ligase Buffer 1μL，步骤B)获得的基因组DNA片段5μL，步骤B)获得的线性化载体3μL，T4 DNA Ligase 1μL；

D)将连接产物转化大肠杆菌感受态GT115细胞，于低盐固体LB培养基中37℃培养12h，获得单克隆；

E)挑取全部单克隆，用含有博来霉素的低盐液体LB于37℃，180rpm摇床中避光培养12h；

F)提取菌液中的质粒并用限制性内切酶BamH I和Hind III进行双酶切验证正确后将质粒贮存于-20℃；

G)以pEGFP-N1质粒为模板，以SEAP-P-F和SEAP-P-R为上下游引物，进行PCR扩增CMV启动子并测序鉴定；

PCR反应体系：2.5μL 10×Taq Easy Buffer，2μL 2.5mM的dNTPs，0.5μL 5U/μL的Taqpolymerase，1μL 10μM的上游引物，1μL 10μM的下游引物，10ng/μL的模板1μL，ddH₂O补足至总体系为25μL；

PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，40个循环；72℃延伸10min；

H)用限制性内切酶BamH I和HindIII酶切步骤G)获得的CMV启动子目的片段，于37℃反应4h，即获得可用于连接反应的目的片段；

酶切体系：2μL 10×Buffer BamH I，5μL步骤G)获得的DNA片段，0.8μL 10U/μL的限制性内切酶BamH I，1.6μL 10U/μL的限制性内切酶HindIII，ddH₂O补足至总体积20μL；

I)配制步骤B)获得的线性化的Pro-free-trapc载体和步骤H)获得的目的片段的连接反应体系，于22℃反应1h，获得重组质粒Pro-CMV-trap；

连接反应体系：14μL步骤H)获得的酶切片段，3μL步骤B)获得的线性化的Pro-free-trap载体，2μL 10×T4 DNA Ligase Buffer，1μL T4 DNA Ligase；

J)连接产物转化大肠杆菌GT115感受态细胞，并涂布于低盐LB固体培养基上37℃培养12h，获得单克隆；

K)挑取单克隆，用含有博来霉素的低盐液体LB于37℃，180rpm摇床中避光培养12h；将阳性克隆菌液进行测序鉴定并提取质粒；

L)将脂质体用细胞培养液稀释25倍，室温放置5min，将步骤K)获得的质粒分别加入稀释好的脂质体中，均匀混合，室温放置20min；

M)将对数生长期的小鼠乳腺癌4T1细胞接种于24孔细胞培养板中，每孔中均匀分散5×10⁵个细胞并加入500μL无抗生素含10％血清的细胞培养基，37℃，5％CO₂培养24h；转染前弃去各孔中的细胞培养基，向各孔中加入步骤L)获得的质粒与脂质体的混合物，混匀后于摇床缓慢摇匀10min，于37℃，5％CO₂培养5小时后吸出细胞培养液，换成500μL无抗生素含10％血清的新鲜培养液，于37℃，5％CO₂培养；

转染36h后，检测碱性磷酸酶活性；并设置mSEAP阳性对照质粒及阴性对照脂质体Lipofecton 2000。

2.根据权利要求1所述启动子及增强子捕获技术的方法，其特征在于，步骤C)所述的基因组DNA片段是这样获得的：用限制性内切酶BamH I和Hind III在37℃，4h对基因组DNA进行随机酶切；步骤M)对于重组质粒启动子或增强子活性的检测步骤是这样的：将脂质体与随机基因组片段转染细胞36h后，收集每孔中的细胞上清液10000rpm离心5min，取离心后的上清液将样品放在65℃水浴加热5～10min，用来抑制细胞的內源碱性磷酸酶活性；在样品中加入1×Dilution Buffer 50μL，1×Assay Buffer 100μL，L-高精氨酸20μL，H₂O 20μL；在37℃水浴加热10min；在各个孔中加入20μL SEAP底物(PNPP)，注意避光在避光条件下37℃水浴10min，在OD₄₅₀条件下检测碱性磷酸酶活性，其指标可作为启动子或增强子活性检测标准。