[发明专利]一种具有免疫活性和抗红细胞溶血活性的新型多肽及其制备方法

摘要

本发明公开了一种具有免疫活性和抗红细胞溶血活性的新型多肽及其制备方法。该方法如下取麦胚球蛋白为原料，通过碱性蛋白酶水解3h，经过DEAE‑Sepharose阴离子交换层析和Sephadex G15凝胶渗透层析筛选出一种具有高免疫活性的多肽。此外该多肽还具有抗红细胞溶血的功效。该多肽在80μg/mL时促进RAW 264.7细胞分泌NO、IL‑6和TNF‑α的能力与空白对照比分别提高了6.65、118.06和17.66倍；在1.5mg/mL时红细胞溶血率仅有21.26%，同时可以使受损的红细胞基本恢复到正常的细胞形态。

主权项

一种具有免疫活性和抗红细胞溶血活性的新型多肽的制备方法，其特征在于，取麦胚球蛋白为原料，用碱性蛋白酶水解，冷冻干燥后，用DEAE‑Sepharose阴离子交换层析和Sephadex G15凝胶渗透层析筛选出免疫活性较高的多肽，再经过半制备RP‑HPLC和MALDI‑TOF‑MS质谱分析得出该肽的分子量为656Da，氨基酸序列为Glu‑Cys‑Phe‑Ser‑Thr‑Ala；具体包括如下步骤：（1）麦胚球蛋白提取：将过100‑300目的脱脂小麦胚芽粉以1：10‑1:30 （w/v）的比例加入水，在20‑40℃下搅拌1‑3h，6000‑9000r/min低温离心10‑20min后，将沉淀继续以1：10‑1:30w/v的比例添加50‑100mM Tris‑HCl，所述Tris‑HCl中含0.3‑0.5M NaCl的溶液，所述Tris‑HCl 的pH 为7.5‑8.5，同样在20‑40℃下搅拌1‑3h，6000‑9000r/min低温离心10‑20min；获得的上清液用0.1‑1M的HCl调pH至4.0，6000‑9000r/min低温离心10‑15min后，复溶并调pH至6.5‑7.5，然后透析并冷冻干燥，得到麦胚球蛋白；（2）酶解：将上述所得麦胚球蛋白配成质量百分比为4%‑5%的蛋白溶液，在90‑95℃保温5‑10min，再冷却至50℃，用0.1‑1M NaOH调节pH,使pH值至7.5‑8.0，加入碱性蛋白酶，在45‑55℃水浴下水解3h，反应过程中不断加入0.1‑1M的NaOH，使pH保持不变，水解完成后，调节pH至6.5‑7.5，95‑100℃灭酶5‑10min，冷却后，6000‑9000r/min离心5‑10min，保留上清液并冷冻干燥，得到粗肽；（3）分离纯化及结构鉴定：将得到的粗肽按2.5：1‑5:1（w/v）的比例加入水，取5‑10mL加入装填了DEAE‑Sepharose阴离子填料的柱子中；所述填料体积为柱子体积的1/3或1/2，依次用水、0.05、0.1、0.3和0.5M NaCl溶液进行梯度洗脱，每个梯度3‑4h，流速30‑35转/min，在220nm有吸收峰的洗脱液透析和冷冻干燥后，取0.3M NaCl洗脱组分；将免疫活性最高的组分按5：1‑10:1（w/v）的比例加入水，取1‑1.5mL加入装填了Sephadex G15填料的层析柱；所述填料体积占柱子体积的90%‑95%，以10‑15转/min的流速收集样品，在220nm共有两个吸收峰，冻干后，得到两种组分，取免疫活性最高的组分，按10:1‑20:1的比例加入超纯水，每次取0.2‑1mL上半制备RP‑HPLC柱，流动相为乙腈/超纯水/三氟乙酸（15%/85%/0.1%），只有单一的一个峰被洗脱出来，收集并冻干后，按1：1‑2:1比例加入超纯水，取1μL点在MALDI靶板上自然晾干放入MALDI‑TOF‑MS质谱仪的样品室进行测定，累加10次单次扫描信号为最终一级质谱图；完成一级质谱后，将信号较强的肽段进行提取，获得二级质谱；标注出主要的a、b、y和z系列由母离子碎裂后得到的子离子，人工推测氨基酸序列，得到具有免疫活性和抗红细胞溶血活性的新型多肽。