[发明专利]一种具有免疫活性和抗红细胞溶血活性的新型多肽及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于农产品深加工及其副产品综合利用的技术领域，具体涉及一种具有免疫活性和抗红细胞溶血活性的新型多肽及其制备方法。

背景技术

麦胚球蛋白在脱脂小麦胚芽中占的比例约为15.6%。球蛋白的氨基酸含量均衡，必需氨基酸占总氨基酸的比例（E/T）在麦胚各蛋白中最高，其中苏氨酸、缬氨酸、组氨酸、苯丙氨酸等必需氨基酸含量较高。除蛋氨酸外，其它必需氨基酸与FAO/WHO推荐模式相符。球蛋白的蛋白消化率在麦胚各蛋白中最高，是非常有价值的天然蛋白质。目前已发现碱性蛋白酶水解球蛋白可以获得高免疫活性肽，但是对它的氨基酸序列以及其它生物活性尚属未知领域。因此以小麦胚芽球蛋白为原料，发现新型多肽，并研究它的多种生理功能，对小麦胚芽蛋白尤其是球蛋白的开发利用具有深远意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有免疫活性和抗红细胞溶血活性的新型多肽及其制备方法。本发明所得多肽同时兼具免疫和抗红细胞溶血两种活性。

本发明以小麦胚芽球蛋白为原料制备的新型活性肽，其分子量是656Da，氨基酸序列为Glu-Cys-Phe-Ser-Thr-Ala。该多肽具有免疫活性和抗红细胞溶血活性，在80μg/mL时促进RAW 264.7细胞分泌NO、IL-6和TNF-α的能力与空白对照比分别提高了6.65、118.06和17.66倍；在1.5mg/mL时红细胞溶血率仅有21.26%，同时可以使受损的红细胞基本恢复到正常的细胞形态。

本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。

一种具有免疫活性和抗红细胞溶血活性的新型多肽的制备方法，取麦胚球蛋白为原料，用碱性蛋白酶水解，冷冻干燥后，用DEAE-Sepharose阴离子交换层析和Sephadex G15凝胶渗透层析筛选出免疫活性较高的多肽，再经过半制备RP-HPLC和MALDI-TOF-MS质谱分析得出该肽的分子量为656Da，氨基酸序列为Glu-Cys-Phe-Ser-Thr-Ala，该肽是首次被发现的新型多肽；所述多肽同时还具有抗红细胞溶血功效。

本发明具体包括如下步骤：

（1）麦胚球蛋白提取：将过100-300目的脱脂小麦胚芽粉以1：10-1:30 （w/v）的比例加入水，在20-40℃下搅拌1-3h，6000-9000r/min低温离心10-20min后，将沉淀继续以1：10-1:30w/v的比例添加50-100mM Tris-HCl，所述Tris-HCl中含0.3-0.5M NaCl的溶液，所述Tris-HCl 的pH 为7.5-8.5，同样在20-40℃下搅拌1-3h，6000-9000r/min低温离心10-20min；获得的上清液用0.1-1M的HCl调pH至4.0，6000-9000r/min低温离心10-15min后，复溶并调pH至6.5-7.5，然后透析并冷冻干燥，得到麦胚球蛋白；

（2）酶解：将上述所得麦胚球蛋白配成质量百分比为4%-5%的蛋白溶液，在90-95℃保温5-10min，再冷却至50℃，用0.1-1M NaOH调节pH,使pH值至7.5-8.0，加入碱性蛋白酶，在45-55℃水浴下水解3h，反应过程中不断加入0.1-1M的NaOH，使pH保持不变，水解完成后，调节pH至6.5-7.5，95-100℃灭酶5-10min，冷却后，6000-9000r/min离心5-10min，保留上清液并冷冻干燥，得到粗肽；