[发明专利]一种可溶性人干细胞生长因子融合蛋白表达载体及其应用

摘要

本发明公开了一种可溶性人干细胞生长因子融合蛋白表达载体及其应用，具体步骤如下形成新的序列nhSCGF‑α如序列表SEQ‑2所示，形成新的nPDI如序列表SEQ‑4所示；重组成新的序列即为nhSCGFα‑pp‑nPDI；将nhSCGFα‑pp‑nPDI基因克隆到pET28a表达载体上，即重组表达质粒为pET28a‑nhSCGFα‑pp‑nPDI，简称28a‑nhSCGF，相应表达出的重组蛋白为hSCGFα‑pp‑PDI；将构建好的pET28a‑nhSCGFα‑pp‑nPDI转化到大肠杆菌BL21(DE3)，用IPTG诱导表达，收集菌株，同时将Prescission Protease的质粒转入BL21(DE3)菌株中，同样IPTG诱导表达，收集菌株，最后将两种菌株按比例混合；得到含hSCGF蛋白的溶液；将含有hSCGF蛋白的溶液上镍离子亲和柱纯化处理后，透析过夜，得到高纯度的人干细胞生长因子。本发明具有表达稳定、不易降解等优点。

主权项

一种可溶性人干细胞生长因子融合蛋白表达载体及其应用，其特征在于：具体步骤如下：一、根据大肠杆菌对密码子的偏爱，替换掉大肠杆菌不利表达的密码子以优化人干细胞生长因子hSCGF‑α如序列表SEQ‑1所示,形成新的序列nhSCGF‑α如序列表SEQ‑2所示，替换掉大肠杆菌不利表达的密码子以优化分子伴侣PDI如序列表SEQ‑3所示的全长基因序列，形成新的nPDI如序列表SEQ‑4所示；二、在人干细胞生长因子nhSCGF‑α和分子伴侣nPDI基因序列之间加入Prescission Protease蛋白酶切位点序列pp如序列表SEQ‑5所示,这样可重组成新的序列即为nhSCGFα‑pp‑nPDI；三、将nhSCGFα‑pp‑nPDI基因克隆到pET28a表达载体上，即重组表达质粒为pET28a‑nhSCGFα‑pp‑nPDI，简称28a‑nhSCGF，相应表达出的重组蛋白为hSCGFα‑pp‑PDI；四、将构建好的pET28a‑nhSCGFα‑pp‑nPDI转化到大肠杆菌BL21(DE3)，用IPTG诱导表达，收集菌株，同时将Prescission Protease的质粒转入BL21(DE3)菌株中，同样IPTG诱导表达，收集菌株，最后将两种菌株按比例混合；五、用PBS缓冲液重悬混合菌液，超声破碎后，离心收集上清，将pH调至7.5‑8.0，低温震荡使Prescission Protease将重组蛋白完全酶切，得到含hSCGF蛋白的溶液；六、将含有hSCGF蛋白的溶液上镍离子亲和柱纯化处理后，透析过夜，得到高纯度的人干细胞生长因子。