[发明专利]一种可溶性人干细胞生长因子融合蛋白表达载体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体来说是一种可溶性人干细胞生长因子融合蛋白表达载体及其应用。

背景技术

人干细胞生长因子α是一种造血生长因子，在骨髓造血微环境中起作用的早期刺激因子，具有多种生物活性,hSCGF-α可由多种细胞(尤其是在骨髓组织中)产生，例如成纤维细胞、足细胞、基质细胞、肝细胞、卵细胞等。

1997年日本Mio H等在人原始骨髓祖细胞中克隆出完整的SCGF的完整cDNA序列。现已清楚，人干细胞生长因子α基因定位于人染色体19q13.3，由4个外显子和3个内含子组装成,hSCGF-α成熟mRNA共有972bp,编码323个氨基酸，表达蛋白大小约为45KDa,这种蛋白在人、小鼠和大鼠的氨基酸数分别为323bp、328bp和328bp，后两者与人类蛋白的相似度均为90.4％,hSCGF-α是非糖基化的物种特异性细胞因子，属于C型凝集素(C-type lectin)超家族成员。研究证实，hSCGF支持红细胞或骨髓祖细胞增殖，可促进血管生成，在创伤愈合过程中有显著作用。hSCGF-α也可作用于真皮层的成纤维干细胞，使处于休眠、损伤的成纤维细胞被激活和修复并形成大成熟的成纤维细胞。因此，hSCGF-α作为一种生物活性蛋白，其在化妆品、创面修复和药品制作中具有较大的研究应用和市场需求。

目前，所采用的基因工程表达hSCGF-α的方法主要为酵母细胞表达和大肠杆菌表达，其中酵母发酵表达常常需要数日，容易降解，表达不稳定等缺点,大肠杆菌表达虽然省时省力，但表达产物多为无活性的包涵体，需要复杂的蛋白变复性操作，也易造成目的蛋白丢失，不利于规模化生产。

本发明的目的在于提供一种可溶性人干细胞生长因子融合蛋白表达载体，以提高hSCGF-α蛋白的可溶性和表达量，以满足市场对hSCGF的需求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中的容易降解、表达不稳定的缺陷，而提供一种可溶性人干细胞生长因子融合蛋白表达载体及其应用。

本发明解决上述技术问题提供的技术方案是：本发明公开了一种可溶性人干细胞生长因子融合蛋白表达载体及其应用，具体步骤如下：

一、根据大肠杆菌对密码子的偏爱，替换掉大肠杆菌不利表达的密码子以优化人干细胞生长因子hSCGF-α如序列表SEQ-1,形成新的序列nhSCGF-α如序列表SEQ-2所示，替换掉大肠杆菌不利表达的密码子以优化分子伴侣PDI如序列表SEQ-3所示的全长基因序列，形成新的nPDI如序列表SEQ-4所示；

二、在人干细胞生长因子nhSCGF-α和分子伴侣nPDI基因序列之间加入Prescission Protease蛋白酶切位点序列pp如序列表SEQ-5所示,这样可重组成新的序列即为nhSCGFα-pp-nPDI；

三、将nhSCGFα-pp-nPDI基因克隆到pET28a表达载体上，即重组表达质粒为pET28a-nhSCGFα-pp-nPDI，简称28a-nhSCGF，相应表达出的重组蛋白为hSCGFα-pp-PDI；

四、将构建好的pET28a-nhSCGFα-pp-nPDI转化到大肠杆菌BL21(DE3)，用IPTG诱导表达，收集菌株，同时将Prescission Protease的质粒转入BL21(DE3)菌株中，同样IPTG诱导表达，收集菌株，最后将两种菌株按比例混合；

五、用PBS缓冲液重悬混合菌液，超声破碎后，离心收集上清，将pH调至7.5-8.0，低温震荡使Prescission Protease将重组蛋白完全酶切，得到含hSCGF蛋白的溶液；

六、将含有hSCGF蛋白的溶液上镍离子亲和柱纯化处理后，透析过夜，得到高纯度的人干细胞生长因子。

作为优选，所述的SEG-1序列说明如下：

(1)序列描述：SEG-1

(2)分子类型：hSCGFα全长序列

(3)序列特征：

a.长度：969bp

b.拓扑学：线性

c.类型：核苷酸

d.序列为：

作为优选，所述的SEG-2序列说明如下：

(1)序列描述：SEG-2

(2)分子类型：hSCGFα优化后的全长序列，即nhSCGF

(3)序列特征：

a.长度：969bp

b.拓扑学：线性

c.类型：核苷酸

d.序列为