[发明专利]一种可溶性人干细胞生长因子融合蛋白表达载体及其应用

权利要求书

1.一种可溶性人干细胞生长因子融合蛋白表达载体及其应用，其特征在于：具体步骤如下：

一、根据大肠杆菌对密码子的偏爱，替换掉大肠杆菌不利表达的密码子以优化人干细胞生长因子hSCGF-α如序列表SEQ-1所示,形成新的序列nhSCGF-α如序列表SEQ-2所示，替换掉大肠杆菌不利表达的密码子以优化分子伴侣PDI如序列表SEQ-3所示的全长基因序列，形成新的nPDI如序列表SEQ-4所示；

二、在人干细胞生长因子nhSCGF-α和分子伴侣nPDI基因序列之间加入Prescission Protease蛋白酶切位点序列pp如序列表SEQ-5所示,这样可重组成新的序列即为nhSCGFα-pp-nPDI；

三、将nhSCGFα-pp-nPDI基因克隆到pET28a表达载体上，即重组表达质粒为pET28a-nhSCGFα-pp-nPDI，简称28a-nhSCGF，相应表达出的重组蛋白为hSCGFα-pp-PDI；

四、将构建好的pET28a-nhSCGFα-pp-nPDI转化到大肠杆菌BL21(DE3)，用IPTG诱导表达，收集菌株，同时将Prescission Protease的质粒转入BL21(DE3)菌株中，同样IPTG诱导表达，收集菌株，最后将两种菌株按比例混合；

五、用PBS缓冲液重悬混合菌液，超声破碎后，离心收集上清，将pH调至7.5-8.0，低温震荡使Prescission Protease将重组蛋白完全酶切，得到含hSCGF蛋白的溶液；

六、将含有hSCGF蛋白的溶液上镍离子亲和柱纯化处理后，透析过夜，得到高纯度的人干细胞生长因子。

2.根据权利要求1所述的一种可溶性人干细胞生长因子融合蛋白表达载体及其应用，其特征在于：所述的SEG-1序列说明如下：

(1)序列描述：SEG-1

(2)分子类型：hSCGFα全长序列

(3)序列特征：

a.长度：969bp

b.拓扑学：线性

c.类型：核苷酸

d.序列为：

3.根据权利要求1所述的一种可溶性人干细胞生长因子融合蛋白表达载体及其应用，其特征在于：所述的SEG-2序列说明如下：

(1)序列描述：SEG-2

(2)分子类型：hSCGFα优化后的全长序列，即nhSCGF

(3)序列特征：

a.长度：969bp

b.拓扑学：线性

c.类型：核苷酸

d.序列为

4.根据权利要求1所述的一种可溶性人干细胞生长因子融合蛋白表达载体及其应用，其特征在于：所述的SEG-3序列说明如下：

(1)序列描述：SEG-3

(2)分子类型：PDI全长序列

(3)序列特征：

a.长度：1476bp

b.拓扑学：线性

c.类型：核苷酸

d.序列为

5.根据权利要求1所述的一种可溶性人干细胞生长因子融合蛋白表达载体及其应用，其特征在于：所述的SEG-4序列说明如下：

(4)序列描述：SEG-4

(5)分子类型：PDI优化后的全长序列,即nPDI

(6)序列特征：

a.长度：1476bp

b.拓扑学：线性

c.类型：核苷酸

d.序列为

6.根据权利要求1所述的一种可溶性人干细胞生长因子融合蛋白表达载体及其应用，其特征在于：所述的SEG-5序列说明如下：

(1)序列描述：SEG-5

(2)分子类型：Prescission Protease酶切位点

(3)序列特征：

a.长度：24bp

b.拓扑学：线性

c.类型：核苷酸

d.序列为

1 CTGGAAGTTC TGTTCCAGGG GCCC。