[发明专利]一种利用枯草芽孢杆菌表达系统快速、高效筛选抗菌基因的方法

摘要

本发明公开了一种利用枯草芽孢杆菌表达系统快速、高效的筛选抗菌基因的方法，其步骤是：先诱导表达植物中存在的抗性基因，构建一个完整的cDNA文库，再导入到枯草芽孢杆菌中，利用其分泌表达系统，表达重组质粒，先筛选对枯草芽孢杆菌产生致死作用的转化子，再进一步经过抗线虫筛选及粗蛋白抑菌筛选，从而能够快速高效的得到抗性基因进行后续验证工作。本发明快速、优质、高效，且目的性强，筛选工作相对简单，得到阳性克隆的概率高。

主权项

1.一种利用枯草芽孢杆菌表达系统快速、高效筛选抗菌基因的方法，其步骤为：/n1)含目标基因的cDNA文库的制备：/na.在健康植株上接种病原菌，诱导抗性基因的表达后，提取目标植物总RNA；/nb.分离纯化mRNA；/nc.设计含Xba Ⅰ酶切位点的Oligo dt，其序列为5′-ACAGGCTCTAGAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′，合成cDNA第一条链，以第一条链为模板合成第二条cDNA链；cDNA合成完成后，加上含Nde Ⅰ酶切位点的接头，所述的接头有3对，序列如下：/n /n /n /nd.cDNA连接载体：将步骤c中的加完接头的cDNA用限制性核酸内切酶Xba Ⅰ和Nde Ⅰ双酶切后，连接到质粒pBE-S上；/ne.将连接体系转化到大肠杆菌高效感受态细胞中，扩增质粒；群体提质粒后转化枯草芽孢杆菌WB800，挑取不少于2000个转化子，保存备用；/n2)致死菌株的筛选/na.将转化子在标记卡那霉素抗性的LB培养基中摇培过夜后，于相同抗性的平板上点样，筛选出原本长势正常但后期变成透明或半透明状的菌株，初步确认，该基因具有致死作用；/nb.将上述初步确认的含致死基因菌液摇培后提取质粒，经大肠杆菌扩增后重新转化枯草芽孢杆菌WB800和枯草芽孢杆菌野生菌株168，均出现了致死表型，表明致死表型由插入的基因引起，该基因作为下一步的候选基因；/n3)抗线虫基因的筛选/n采用滤纸片法测定含候选基因的转化子对秀丽隐杆线虫的抗性，以枯草芽孢杆菌WB800作为对照，测定选择指数，选择指数公式如下：选择指数＝(含候选基因的转化子菌落内的线虫数量—枯草芽孢杆菌WB800菌落内的线虫数量)/线虫总数，选择指数小于-30％的转化子具有抗线虫作用，用于下一步的筛选；/n4)抗菌基因的筛选/n硫酸铵沉淀法提取步骤3)中含抗线虫基因的菌株的胞外粗蛋白，以空载体菌株为对照，滤纸片法测定粗蛋白的抑菌效果，抽提质粒和基因测序，由此得到相应的抗菌基因。/n