[发明专利]一种大片段基因整合提高黑曲霉纤维素酶酶活的方法

摘要

本发明公开了一种大片段基因整合提高黑曲霉纤维素酶酶活的方法，属于基因工程领域。本发明通过多次同源重组将里氏木霉维素酶系相关的基因大片段一次性整合到黑曲霉基因组中，具体为：将两段黑曲霉基因组片段、潮霉素抗性基因单元盒整合到里氏木霉基因组上，再以这两段片段为同源重组位点、潮霉素抗性为筛选标记将里氏木霉基因组上这两个位点之间的大片段整合到了黑曲霉基因组上，达到纤维素酶基因、非纤维素酶基因多克隆的效果，从而影响黑曲霉的代谢网络，提高黑曲霉的纤维素酶酶活。通过本发明方法得到的菌株的滤纸酶活是出发菌株的2.17倍。

主权项

1.一种大片段基因整合提高黑曲霉纤维素酶酶活的方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)合成两端含有限制性内切酶酶切位点序列的如下DNA片段：DNA片段1，由以下序列组成，依次为：酶切位点序列1、里氏木霉(Trichoderma reesei)基因同源片段前段1、潮霉素抗性基因单元盒、黑曲霉(Aspergillus niger)基因组片段1、里氏木霉基因同源片段后段1、酶切位点序列2；DNA片段1‑2，由以下序列组成，依次为：酶切位点序列1、里氏木霉基因同源片段前段1、黑曲霉基因组片段1、酶切位点序列2；DNA片段2，由以下序列组成，依次为：酶切位点序列1、里氏木霉基因同源片段前段2、潮霉素抗性基因单元盒、黑曲霉基因组片段2、里氏木霉基因同源片段后段2、酶切位点序列2；其中，里氏木霉基因同源片段前段1的序列如SEQ ID NO.1所示，潮霉素抗性基因单元盒的序列如SEQ ID NO.2所示，黑曲霉基因组片段1的序列如SEQ ID NO.3所示，里氏木霉基因同源片段后段1的序列如SEQ ID NO.4所示，里氏木霉基因同源片段前段2的序列如SEQ ID NO.5所示，黑曲霉基因组片段2的序列如SEQ ID NO.6所示，里氏木霉基因同源片段后段2的序列如SEQ ID NO.7所示；(2)将步骤(1)中的3个DNA片段分别连接到载体上构建得到同源重组载体1、同源重组载体1‑2、同源重组载体2；(3)用同源重组载体1转化里氏木霉，筛选得到同源重组成功的里氏木霉菌株1；用同源重组载体1‑2转化里氏木霉菌株1，筛选得到同源重组成功的里氏木霉菌株1‑2；用同源重组载体2转化里氏木霉菌株1‑2，筛选得到同源重组成功的里氏木霉菌株2；(4)将里氏木霉菌株2的基因组断裂片段导入到黑曲霉，以潮霉素抗性作为筛选标记，筛选得到同源重组成功的黑曲霉菌株G，黑曲霉菌株G的纤维素酶酶活得到提高；所述的基因组断裂片段为将基因组DNA用移液枪反复吹打、并用枪头在离心管壁反复碾压得到。