[发明专利]蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法

摘要

本申请公开了蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法：取新鲜蚕豆根系；液氮研磨；酚抽提液；Tris平衡酚饱和溶液；离心收集上层酚；0.1mol/L醋酸铵‑甲醇溶液；离心收集沉淀；甲醇清洗；离心收集沉淀；真空干燥沉淀；加入样品裂解液；离心取上清；蛋白定量；分装冷冻；样品水化；样品制备完成。本发明以蚕豆根系为实验材料，填补了蚕豆根系双向电泳技术的空白。本发明中实验步骤简单，易于操作，重复性好，有实验背景的技术人员易学、易掌握。本发明中选用的实验试剂均为双向电泳常规试剂，无昂贵、稀有试剂，实验运作成本低。

主权项

蚕豆根系蛋白质组学分析的样品制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)取新鲜蚕豆根系；(2)将所取样品置于预冷至‑20℃的研钵内，用液氮快速冷冻并充分研磨至细粉；(3)研磨好的粉末中加入10倍体积酚抽提液，不定时涡旋混匀等待20min后，加入等体积的Tris平衡酚饱和溶液(pH8.0)，4℃放置30min，期间每5min摇晃混匀一次；离心后收集上层酚液；(4)向步骤(3)所述的上层酚液中加入预冷的0.1mol/L醋酸铵‑甲醇溶液，‑20℃沉淀过夜后，离心收集沉淀；(5)步骤(4)所述的沉淀中加入预冷甲醇，轻微混合后，4℃离心，弃上清液，沉淀中加入预冷丙酮，轻微混合，4℃离心，收集沉淀；(6)步骤(5)所得的沉淀真空干燥至水分≤8％，得粉末；(7)步骤(6)所得粉末溶解液于样品裂解液，23℃下放置3h以上，期间涡旋混匀2～3次；(8)裂解结束后，离心取上清液，上清液再次离心，取上清液作为待分析溶液；(9)绘制标准曲线，取待分析的上清液与考马斯亮蓝蛋白试剂反应，测定吸光值，根据标准曲线测定待分析溶液中蛋白质的浓度；样品蛋白浓度(μg/μl)＝X/样品体积(μl)；(10)按根系蛋白总上样量200μg，上样总体350μl，计算蛋白体积，并分装后‑80℃保存；样品蛋白体积(μl)＝200μg/样品蛋白浓度(11)从‑80℃取出蛋白样品，自然溶解后按上样总体350μl和蛋白体积，计算出水化液体积，加入蛋白样品水化液，离心，即得蚕豆根系蛋白质组学分析样品；水化液体积＝350μl‑蛋白体积。